那些年我们一起追过的转录组问题~
2018.08.16

七夕将至,最近小编的朋友圈已被各种秀恩爱的刷屏了,宝宝很是苦恼,在这个既温馨又伤感的节日里,想想自己曾经追过的女生,想想自己曾经。。。,算了,还是想想曾经困扰过自己的转录问题吧~RNA-seq已被广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域,今天小编就为大家整理了一波RNA-seq常见问题解答,给这个七夕的朋友圈来一点不一样的~


样本制备注意事项有哪些?


1.细胞类样本送样注意事项


细胞系样本培养过程中常会出现支原体污染,将直接影响细胞生长状态。对于去rRNA链特异性文库,因去rRNA试剂盒具有物种、组织部位特异性,针对真核生物的去rRNA试剂盒无法去除支原体rRNA,会严重影响数据质量以及有效数据比例,对分析结果的准确度产生干扰。


建议细胞类样本在测序前,先使用一步法支原体检测试剂盒或qPCR技术进行支原体检测,从源头有效避免支原体污染。


2.对于植物、动物、酵母等来源的RNA,一般推荐用哪种方法进行提取


RNA提取质量的好坏主要取决于样品本身的新鲜程度和多糖多酚、次生代谢物的含量;针对大多数的动植物组织样品,Trizol试剂都能获得较好的提取效果;对于多糖含量特别丰富的植物组织,如棉花根、桦树根、兰花等,可采用天根多糖多酚试剂盒提取;对于脂肪组织,可采用QIAGEN的RNeasy lipidmini kit 进行提取。


样本检测时需要达到什么要求才认为样品合格


样本检测主要关注的指标为总量、RIN值、OD260/280以及28S/18S(原核生物为23S/16S)。其中RIN值及28S/18S是评估RNA完整性的主要指标,RIN值越高,28S/18S越接近2表明完整性越好。一般RIN值大于6.5可尝试建库,RIN值过低会影响分析结果的准确度。但对于一些特殊样品,比如某些昆虫和水产动物,没有28S条带,就不能参考RIN值,一般只要18S前基线平稳可认为样品合格。


生物学重复应该如何来设定

1.区分生物学重复与技术重复


生物学重复:指样本重复,不同生物样本做同样实验;

技术重复:一般是对一个生物样本的实验指标测定多次。


如下图:对照组A、B、C三只小鼠(control A,B and C)互为生物学重复。实验组A、B、C三只小鼠(Treated A)同样互为生物学重复。任一小鼠在板A、B、C中被重复测量了三次,即技术重复了三次。


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2.生物学重复设置几个合适


一般推荐生物学重复≥3,动物或人的个体差异比较大,建议至少做5-10个重复。


3.生物学重复取样要求


植物取样:所取试验田,长势,外部形态特征相同;

动物取样:遗传背景,饲养条件,年龄,性别,外部形态特征相同;

混合取样:保证混合样品处理方式,处于发育阶段,个体外部形态特征相同。


建库方法如何选择?


1.什么是链特异性文库


链特异性建库可以保留测序时转录本的方向信息,即可以确定转录本是来源于基因组上面的正义链还是反义链,此外,还能确定基因结构,定量转录本,鉴定non-coding转录本等。


2.普通转录组与lncRNA建库方法区别


普通转录组基于真核生物mRNA含有polyA尾的特性,首先用oligodT磁珠富集纯化,然后构建普通转录组文库。

因只有部分lncRNA含有polyA尾,为获得更多的lncRNA有效信息,选用去rRNA试剂盒进行富集,然后通过构建链特异性文库以有效区分不同lncRNA类型及准确定位,保留RNA的方向性信息,以便更加准确的获得基因的结构以及基因表达信息。


3.lncRNA测序前注意事项


1)必须有转录组,且参考基因组组装水平及注释信息完善,至少为scaffold水平。

2)需要有适用的去rRNA试剂盒。


目前主要应用的去rRNA试剂盒为Ribo-Zero以及KAPA试剂盒。对于非常规物种进行lncRNA测序时,需确定有无适用的去rRNA试剂盒,否则rRNA去除效果不佳会严重影响数据质量。


篇幅有限,今天的问题解答就告一段落,本期总结了RNA-seq样本准备和建库问题,下期准备的是RNA-seq关键信息挖掘内容,大家还有没有别的问题或者建议呢,欢迎热情点赞留言,小编会继续整理分享,搓手抖腿期待中~~~我们下期不见不散~~~





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