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混池测序研究中如何不被这些问题困扰?

2017-02-10


混池测序(Pool-seq),是利用集群分离分析法(Bulk segregant analysis,BSA)快速有效地寻找与目标性状相关联候选基因区域的高效低时耗低成本的方法。方法虽好,但要把它付诸于实践,中间还隔着一箩筐问题。小编将几个重要问题进行了汇总,各位看官还有什么问题欢迎留言哦~



产品定位效果


混池测序相对GWAS或其他精细定位分析策略来说,其实是一个初定位产品,定位的最终结果是一个极有可能跟性状相关的候选区域。候选区域的大小及区域内基因个数多少还受到物种参考基因组的组装好坏(建议采用组装到染色体水平的参考基因组)、基因组注释情况、目标性状的特点、测序深度等因素的影响。



不同样本情况的分析策略



目前混池测序主要根据不同的样品收集及处理情况可分为QTL-seq、MutMap、MutMap+、MutMap-Gap四种不同的分析策略,其中后两种相对来说较为小众。这四种策略全部由日本京都大学RyoheiTerauchi 团队开发[1-5],每种分析策略都有适用的范围。

 样本选择


样本选择建议参考“针对不同的样本情况的分析策略”。关于子代混池的样本数量问题,虽然常规建议是在样本量允许的情况下越大越好,可一定程度上缩小候选区域[6]。建议每个混池样本量≥30个样每池。其中还需考虑混池中极端性状比例问题,过低则混池中样品数不够,过高则会产生噪音干扰,出现假阳性的比例增加。



测序深度



根据文献报道和项目经验,常规样本推荐亲本测序深度 10X~20X,子代混池测序当样本量大于20个时其测序深度 ≥30X。如果想分析亲本其它大的变异分析(SV、CNV)等,建议加大测序深度。当然不同的样本群体培育方式对于混池测序的样本要求也不一样[7]



可控范围内优化定位结果




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样本策略




1

物种

建议选择组装至染色体水平的参考基因组(参考基因组组装不好;未注释的基因占比过高,容易定位到间区;物种连锁不平衡强,容易候选区域过大)。

2

群体构建

永久群体(RIL)>临时群体(F2)>自然群体。

3

亲本选择

尽可能保证两个亲本,且性状差异单一,杂合位点少。若亲本差异过大,容易定位到假阳性区域;过小,容易定位不到候选区域;少测一个混池会导致假阳性增加,影响SNP过滤。 亲本的基因组是重要的参考,它可以增加分析时选择的余地;过滤SNP;筛选候选基因的重要数据。

4

混池大小

带来F2群体随机错误概率引起的假阳性;混池中极端性状比例过低则混池中样品数不够,过高则会产生干扰。

5

表型统计

表型统计不准确,或表型由多个微效基因控制,会引起定位效果不佳。


 


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个性化分析策略




1

基于InDel 分析。

2

亲本高深度测序简单组装形成亲本参考基因序列后再分析。

3

分析亲本的SV或者CNV,比较候选区域内是否存在亲本SV或者CNV差异。

4

结合染色体区段的多态性进行选择性清除分析(如Fst和Hp),对结果进行验证。




寻找研究焦点


 


1

基因筛选

根据基因功能注释结果,去掉性状无关基因;

结合已有工作(SSR、QTL)缩小候选区域。

2

功能验证

将候选SNPs转化为CAPS或者dCAPS等标记验证;

PCR扩增,一代测序;

RT-PCR验证候选基因的表达变化;

基于转录组数据的差异表达分析,看基因是否有显著表达差异;

功能缺失型实验验证:RNAi,敲除,过表达…






[1]Takagi H, Tamiru M, Abe A, et al. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J].Nature Biotechnology, 2015, 33(5): 445-449.

[2]Takagi H, Uemura A, Yaegashi H, et al. MutMap‐Gap: whole‐genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii[J]. New Phytologist, 2013, 200(1): 276.

[3]Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL‐seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2013, 74(1): 174.

[4]Fekih R, Takagi H, Tamiru M, et al. MutMap+: genetic mapping and mutant identification without crossing inrice[J]. PLoS ONE, 2013, 8(7): e68529.

[5]Sablok G, Kumar S, Ueno S, et al. Whole genome sequencing to identify genes and QTL in rice[M]// Advances in the understanding of biological sciences using next generation sequencing (NGS) approaches[J]Springer International Publishing, 2015: 33-42.

[6]Doitsidou M, Poole R J, Sarin S, et al. C. elegans, mutant identification with a one-step whole-genome-sequencing and SNP mapping strategy[J]. Plos One, 2010, 5(11): e15435-e15435.

[7]James G V, Patel V, Nordström K J, et al. User guide for mapping-by-sequencingin Arabidopsis[J]. Genome Biology, 2013, 14(6): 571-579.

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