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6大秘籍,让你的蛋白质组研究6到飞起~

2018-06-02

时下最流行的蛋白质组标记定量技术iTRAQ和TMT,以及非标记定量技术Label-free无疑是占据了定量蛋白质组学的半壁江山。质谱技术以其稳准狠的特点成功地为多物种绘制了蛋白质谱图并进行相对定量,在生物学和医学等领域得到了广泛应用,为寻找疾病分子标记和药物靶标提供了有效手段。


你对真正的定量蛋白质组学技术又了解多少呢?莫慌,今天小编就来带你一探究竟。(文末有~)


定量蛋白质组学依据目的不同,分为相对定量和绝对定量。相对定量的目的在于寻找不同条件下样本的差异表达蛋白,常用于探究性实验,以得到感兴趣的分子标记物,主要技术手段有iTRAQ/TMT、SILAC、Label-free和SWATH。绝对定量的目的在于对目标蛋白质进行定性和定量分析,常用于验证性实验,主要技术手段有MRM和PRM。


图1.png


相对定量——标记定量法


首先来了解一下时下最热门的iTRAQ和TMT技术吧~


iTRAQ(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)与TMT(Tandem Mass Tags)的关系可谓是既生瑜,何生亮,都是定量蛋白质组体外标记技术,且两者的原理基本相同:通过标记试剂与肽段的N端或赖氨酸侧链发生反应,从而完成对肽段的标记;标记后的肽段利用串联质谱(LC-MS/MS)检测,实现同时对多组研究样本进行蛋白质鉴定和定量。


区别在于两者由不同的公司开发,且标签的标记数量不同。iTRAQ于2004年率先由AB Sciex公司开发,适用于QTOF系列质谱仪,一次可完成对8个样品的标记和定性定量分析。随后,Thermo 公司推出了一次可对10个样品进行标记的TMT,但因其对质谱仪的超高要求,只适用于拥有超高分辨率的Orbitrap系列质谱仪。这两种标记定量方法不依赖于样本,几乎可以对样品中的任何蛋白进行标记,可检测出较低丰度蛋白,胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等,且定量准确,特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析。


iTRAQ试剂结构

iTRAQ试剂结构


标记定量法实验流程(以iTRAQ为例)

标记定量法实验流程(以iTRAQ为例)


相对于体外标记法,SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)的原理则基于体内标记技术:分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白质按细胞数或蛋白量等比例混合,经分离、纯化后进行质谱鉴定。这种方法因在细胞培养时掺入标记,令样品更接近真实状态,减少了实验误差,使得定量更准确,为解决复杂哺乳动物细胞蛋白质组的定量分析提供了有效的手段。


SILAC定量适用于活体培养细胞的分析,可用于细胞全蛋白和膜蛋白的鉴定和定量。SILAC主要利用一级质谱定量,iTRAQ/TMT主要利用二级质谱进行定量。两者的定量准确性及蛋白分辨率方面差别不是很大,但是因SILAC技术实施起来需要的操作复杂、时间长且成本较高等原因,并没有得到大量的商业化应用。


SILAC工作原理

SILAC工作原理


相对定量——非标记定量法


Label-free顾名思义就是通过非标记定量的方法对蛋白质酶解肽段进行鉴定和定量的方法。不需要使用含有稳定同位素标签的试剂,只需要比较两组样品在特定肽段的一级质谱信号强度,便可得到样品间蛋白表达量的变化,通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。


Label-free技术的操作简单,对样品的需求量相对较低,可以做任意样本的总蛋白质差异定量,单次试验可鉴定和定量的蛋白质更多。因此,Label-free技术适合于大样本量的定量比较,以及对无法用标记定量实现的实验设计。但对实验操作的稳定性和重复性要求较高,准确性也较标记定量差,依赖于质谱的稳定性


非标记定量与标记定量方法对比

非标记定量与标记定量方法对比


相对定量——数据非依赖性扫描模式(DIA)


目前流行的蛋白质组学研究手段,如 iTRAQ/TMT、Label-free和SILAC,他们的亲妈都是DDA(data-dependent acquisition,数据依赖型的扫描模式)技术:将蛋白质样品消化成肽段,离子化并通过质谱进行分析;二级质谱只能够采集一级谱图信号最强的 Top20 的信息,所以会造成信息遗漏;在母离子选择的过程中,质谱更偏向于扫描高丰度的肽段


针对上述问题,一项全新的质谱技术SWATH(Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions)应运而生。SWATH作为一种DIA(data-independent acquisition,数据非依赖性的扫描模式)技术,它的理念是对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂,采集所有母离子的碎片离子,并快速地依次扫描相邻的母离子宽口内的所有碎片离子。


DIA 定量可以说是别人家的孩子,相比传统的DDA 定量,DIA有灵敏度高、可重现性高、定量准确度高、通量大等优点。SWATH技术主要应用于蛋白质组定量、蛋白复合体鉴定和宿主蛋白分析等。


DA与DIA扫描模式对比

DA与DIA扫描模式对比

 

绝对定量——靶向分析


靶向蛋白质组学目前主要有两类技术: MRM(multi reaction monitoring, 多反应检测)和PRM(parallel reaction monitoring, 平行反应监测)。SRM(selective reaction monitoring,选择反应检测扫描)是蛋白质组靶向定量的金标准、老大哥。MRM和SRM的原理相同,相当于同时做了多组SRM,主要依赖于三重四级杆质谱仪。检测到与目标分析特异性一致的母离子后,将选定的特异性母离子进行碰撞诱导,去除其他子离子的干扰,只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集,以达到对目标分子的分析特异性更高、灵敏度更高、更准确地目的。


PRM是也基于SRM的升级版技术,主要依赖于高分辨率的Orbitrap质谱仪。借助高分辨率、高质量精度分析器的优势,PRM实现了对子离子的全扫描,省去了对母离子碎片进行选择的步骤。相比于SRM/MRM,PRM的操作更简单,靶向定量结果的选择性和灵敏度更高、重现性更好,在复杂背景中的抗干扰能力也更强。


MRM/PRM 工作原理

MRM/PRM 工作原理


我是彩蛋


下是小编对各路蛋白质组定量技术的吐血式整理,希望可以帮你打通任督二脉~


蛋白质组定量技术


安诺基因在定量蛋白质组学领域有丰富的项目经验,可提供具有业内领先水平的iTRAQ/TMT、Label-free、DIA/SWATH和 MRM/PRM 技术,以及优质快速可靠的数据分析,非靶向探索结合靶向验证、蛋白质组学与转录组学的联合分析,为您提供多种解决方案,在科研和临床领域祝您一臂之力!


参考文献:

[1] Ong, Shao-En., Mann, Matthias.. (2006). Apractical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture(SILAC)., Nat Protoc, 1(6), 2650-60.

[2] Peckner, Ryan., Myers, Samuel A., Jacome, Alvaro Sebastian Vaca., Egertson, Jarrett D., Abelin, Jennifer G., MacCoss, Michael J.,...Jaffe, Jacob D. (2018). Specter: linear deconvolution for targeted analysis of data-independent acquisition mass spectrometry proteomics., Nat.Methods, 15(5), 371-378.

[3] Sweredoski, Michael J., Moradian, Annie., Hess, Sonja.. (2017). High-Resolution Parallel Reaction Monitoring with Electron Transfer Dissociation for Middle-Down Proteomics: An Application to Study the Quantitative Changes Induced by Histone Modifying Enzyme Inhibitors and Activators., Methods Mol. Biol., 1647, 61-69.

[4] Bhargava, Maneesh., Higgins, LeeAnn., Wendt, Christine H., Ingbar, David H.. (2014). Application of clinical proteomics in acute respiratory distress syndrome., Clin Transl Med, 3(1), 34.



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