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三代测序送样指南---RNA篇

2018-06-29

众所周知,全长转录组测序利用了三代测序的超长读长优势,能够直接获得全长转录本信息,无需拼接组装。在全长转录组测序中,好的测序数据与高质量的RNA是密切相关的。自端午节安诺基因推出转录组测序年中促销后,小编收到很多小伙伴的积极反馈。想做了,但是样本制备不是很懂,究竟该如何准备样本才能获得高质量的RNA?本期小编就给大家一一解答。

 

01. 什么样的RNA符合全长转录组测序的要求呢?

 全长转录组测序对RNA的要求


02. 全长转录组测序时是否都要多组织样品混样测序?

这主要与研究目的相关,一般如果为了获得研究物种的全面的转录本信息建议取不同组织提取RNA等摩尔量混合,发表文章中一般取4~6个组织混合较多。如果是研究某个组织的特异性转录本或者功能,建议该组织单独取样测序。


03. 组织收集冻存前是否需要进行预处理?

需要,样本预处理的好坏也直接关系着后续RNA提取的质量。小编将以不同类型的样本为例,分享不同类型样本的处理方法。


 植物样本

一般来说,植物样本取材后需用 DEPC-H2O 将材料表面的灰尘或泥土冲洗干净,吸干,将组织放入2管5-50ml RNase-free的EP管中,每管500mg左右,准确标记,加入RNAlater或类似的RNA组织保存试剂,具有自然屏障如蜡质层的叶组织需要先破坏其屏障,以允许RNAlater进入组织,如若RNAlater未渗透到组织里面,无法起到保护作用,液氮速冻后使用封口膜封口,将EP管放置于密封性较好的小塑料袋中,干冰运输。


植物样本的取材一般选取幼嫩新鲜的组织为宜,避免老叶、树皮以及次生代谢产物含量较多的组织,植物的嫩叶、花、根、穗都是常见的取材部位。


 动物组织样本

动物组织取材尽量在生物体死亡10分钟内进行取材,取材后用RNase-free 的0.9%生理盐水漂洗,以去除血渍和污物,并剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型,吸干,并将样品分割成50mg左右的小块分别放入2管1.5ml 或2.0ml RNase-free 的EP管或螺旋管中,每管放入2小块,并加入RNAlater或类似的RNA组织保存试剂,液氮速冻后用封口膜封口,将EP管放置于50ml离心管中或密封性好的小塑料袋中,干冰运输。


动物组织的选取要避免脂肪细胞含量较高的组织,一般常见的取材部位包括心脏、肝脏、脾脏、肺以及脑组织等。


 悬浮细胞样本

悬浮细胞培养结束后,离心去除培养液;收集的细胞用 PBS 缓冲液快速洗2次,低速离心除去 PBS 缓冲液;每 1~5×106 个细胞加入1ml TRIzol试剂,(RNAlater 保存,1ml的TRizol溶解的细胞数量不能超过107),用一次性注射器进行反复抽打细胞直至看不见成团的细胞块,整个溶液呈清亮而不粘稠的状态;放入干冰或-80°C冰箱中保存,干冰运输。


 血液样本

血液样本推荐使用QIAGEN 公司的 PAXgene Blood RNA Tube 采血,每管盛装 2.5ml的全血,立即温和颠倒10次左右,室温放置2-12h,4°C运输; 或者样品在用抗凝管采集完于4°C环境中,4小时之内送到公司,抗凝剂不能用肝素。


以上的分享,希望能够帮助到各位老师,下期小编会为大家继续介绍三代测序的DNA样本送样指南,不要错过哦~


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