干货~如何分选单细胞?
2018.07.19


---“《创造101》结束了,你Pick的小姐姐出道了吗?”

---“我最近要做单细胞测序,苦于找不到合适的细胞分选方法,哪有时间Pick小姐姐啊!”

---“嗨~单细胞分选可以用有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选、激光显微切割以及微流控分选啊~~我来给你一一介绍下,看看你要Pick哪个吧~~”



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常用单细胞分选方法[1]


1.有限稀释法

有限稀释法是一种常用的单克隆培养方法,也可用于获取单个细胞。其原理主要是基于细胞悬浮液中细胞的分布及浓度进行计算,逐步稀释细胞悬浮液,最终达到一定体积中只存在单个细胞。为了提高单细胞获得率,需要尽可能地进行稀释,在统计学上,以每单位0.5-0.9个细胞为宜。

优点:操作简便,无需特殊仪器设备,成本低。

缺点:对于浓度的计算易存在误差,基于泊松分布原理,即使在理想状态下,单细胞比例也只有约1/3,假阳性率高。


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有限稀释法不同细胞数概率统计[1]


2.显微操作法

显微操作法是通过镜检,对单个细胞进行人工挑选的方法。在制备好适宜浓度的细胞悬浮液后,可置于显微镜下观察,利用口吸管(可由玻璃毛细管拉制而成)将目标细胞吸取出来。条件允许的话,还可使用显微操作仪,该仪器对口吸管、注射仪、毛细针有一定的固定、调节功能,可在一定程度上增加操作的通量以及稳定性。在生殖领域相关的研究中,多采取显微操作法获得单个细胞。

优点:仪器设备要求不高,可准确获取形态完整的活性较高的单细胞。

缺点:对操作人员技术要求高,有人为因素干扰,通量较低。


3.流式细胞分选

如果对通量要求较高,同时目标细胞有适宜的荧光标记,可利用流式细胞仪完成单细胞分选。经荧光染色或标记的单细胞悬液,被高压压入流动室内,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。通过相应荧光检测及充电,获得目的细胞,实现单细胞分离。进行免疫方面的研究时,流式细胞分选为首选分离方法。

优点:通量较高,可分选单个细胞。

缺点:需要具有分选功能的流式细胞仪,有稳定可用的荧光标记或荧光染料,需制备一定量的细胞悬浮液,不适用于微量样本。


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流式细胞分选示意图[2]


4.激光显微切割

激光显微切割适用于组织样本的细胞分选,组织切片经染色后,在显微镜下进行观察,锁定目标区域,利用激光进行切割、分选。某些型号的仪器还可以直接进行活体组织的细胞切割分选(如Leica LMD7000),无需先制备冰冻切片。

优点:可对组织样本进行细胞分选,可结合免疫组化信息。

缺点:需要激光显微切割平台,操作较复杂,包括固定染色等步骤,对核酸产生潜在的损害。


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激光显微切割示意图[1]


5.微流控分选

微流控分选基于流体力学原理实现细胞分选,适用于高通量、大规模的单细胞研究。近两年大热的10x Genomics ChromiumTM就平台就是利用微流控技术进行单个细胞分选,其技术核心是含有75万种Barcode的油滴包裹的凝胶珠(GEMs),能在10分钟内自动完成多至80,000个细胞的捕获,目前广泛应用于细胞分群相关的研究中。

优点:分选通量高,成本低,采用商业化仪器操作简便。

缺点:对细胞悬浮液活性要求较高(至少>85%),细胞总量要求较高,若采用Barcode+UMI扩增原理,无法检测全长转录本。


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10x Genomics微流控分选细胞


以上5种单细胞分选方法,各有利弊,研究者可以根据不同的科研需求及样本情况进行选择。目前,要实现单细胞的分选,第一步往往需要制备细胞悬浮液,对于流式细胞分选以及微流控分选来说,对细胞悬浮液的总量以及活性都有一定的要求。


作为国内单细胞测序技术整体解决方案的领导者,目前安诺基因单细胞多组学研究解决方案已经丰富至三大组学(基因组、转录组、表观组),能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略,使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。


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安诺单细胞测序技术总览


参考文献

[1] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, et al. Technologies for Single-Cell Isolation[J].International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(8):16897.

[2] Sabban S, Ye H, Helm B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεR.[J]. Veterinary Immunology & Immunopathology, 2013, 153(1-2):10-16.




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