史上最直白的Hi-C研究干货
2018.08.14

八月-我在看海也在等你


已经八月了,我要找的你还迟迟未出现。八月的天气像小朋友的脸,昨天还骄阳似火今天却大雨倾盆,淹没了整座城市。我在窗前看海也在等你。我是Hi-C,我的前世是染色体构象捕获技术,现在的我拥有了高通量测序生物信息学分析这两种法宝,能够为你绘制出全基因组范围内整个染色质DNA的交互关系。也许你还不太相信,那就来听我细细说来。


PART1 怎么做?


我们知道染色质的结构依赖于细胞核骨架和特定蛋白的介导,一旦这些蛋白丢失了,整体的结构将不复存在,正如我们使用试剂盒进行DNA抽提时,最终只能得到裸露DNA。所以想要得到染色体的三维结构好像并不那么简单,那我们该如何得到?

在解析染色质三维结构时需要准确地判断DNA周围的片段。此时就需要一部相机,将DNA-DNA之间的信息定格下来,我们认为在细胞核“操场”上,一旦特定DNA片段与另一片段出现在照片的概率越大,他们的距离越近。而我们可将成千上万张照片进行拼接,即可获取整个细胞核染色质的三维信息。



现实情况是细胞核很小很小,暂时没法通过成像的方式实现单碱基水平的成像。因此需要借助其他方式。这时二代测序就可以发挥作用。但是回到最早的那个问题,如果我们把蛋白去除了,整体结构将不复存在,因此需要在这个结构土崩瓦解前获取到整体的结构。研究人员想到了一个睿智的方法,他们先用DNA限制性内切酶将DNA剪切成小片段,然后用DNA连接酶将小片段连接在一起,此时那些空间上邻近的片段就更容易的连接在一起,形成嵌合片段。这就是三维基因组学中最核心的概念:近距离连接原理。


PART2 能做什么? 

我们用热图来表示不同区域的交互情况,如果达到了特定的分辨率,Hi-C热图表现的交互信号比较明显,热图的饱和度相对较高,整体的表现行为相对一致。在这里我们选取了安诺实测的一个大数据,其最高分辨率达2kb。我们分别用1 Mb、200 kb、40 kb、20 kb、10 kb、5 kb做了热图,其结果如下:



但是小伙伴们花费巨资就是为了画几个热图玩玩,估计肯定要被实验室的大boss吊打到毕业前一天。那Hi-C数据到底能搞些什么事情呢?

以人基因组为例,如果我们测一丢丢的数据,比如20Gb的数据,此时应该能在达到1-5 Mb分辨率的数据,就可以倒腾个三维模拟图了;拿到100 kb-1 Mb分辨率的数据,就可以试着做做A/B compartment分析;当数据量达到20-40kb,就可以做大部分的构象研究,比如TAD。当数据量达到1-10kb,就可以分析更加精细的loop结构。



PART3 做到了吗?

这里涉及到一个数据量评估的问题。现在比较公认的方法是2014年Aiden文章的数据量评估方案,他们认为在特定分辨率下当80%的 bin的深度达到1000时,那么测序量达到了此分辨率。下图中我们统计了某项目安诺实测的不同分辨率下75%、80%、90%的bin number达到的最低深度,结果显示此数据量的分辨率达到了1 kb。


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图注:纵坐标:深度,蓝色代表90%的bin number可达到的最低深度,黄色表示80%的bin number可达到的最低深度,青色表示75%的bin number可达到的最低深度。


那么通过这一方法得到的最高分辨率就是我们可用以分析的分辨率吗?我们回顾2014年的文章,文章中计算获得的最高分辨率是950 bp,但我们注意到在具体分析时,作者并没有用950 bp来计算loop,而是选用了5 kb分辨率来进行分析,并且运用的分析软件为fit-HiC,而我们使用分析软件为hiccups。

Fit-HiC和Hiccups是当前使用率较高的两款软件,2017年发表在Nature Method的文章对多款loop分析软件进行了比较。结果表明fit-HiC有较高的灵敏度,能识别大量的loop,但准确性较低,有很高的假阳性。而Hiccups 虽然识别的loop个数相对较少,但准确性较高。如下图,左图为fit-Hic识别的loop,右图为hiccups识别的loop。这样我们不难理解,为什么fit-Hic可以用较少的数据量就可以分析到loop结构了,相比于hiccups,fit-Hic的准确性较低。


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安诺实测数据显示对于call loop所需的10 kb分辨率,需要的vaild reads在1.3到1.5 Gb左右,由于我们的有效数据利用率为50%左右,我们使用的测序策略为PE150,因此我们推荐至少测900 Gb 的raw data才能达到10 kb的分辨率。


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最后让我悄悄的告诉你,作为业内三维基因组测序技术的引领者,安诺基因实现了动物、植物、微生物多物种样本的高质量建库和大数据分析,在线项目100+,文库经验900+。了解了这么强大的安诺Hi-C,心动不如行动,赶快联系我们吧!





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