文库准备好,测序麻烦少
2018.10.17

还没来得及好好享受凉爽的秋日,小编就受到了来自帝都妖风的魔法攻击,只好一边把秋衣秋裤从衣橱底层翻出来,一边质问为什么前几日贴上的秋膘没起半点作用( ´╥ω╥`)。


除了火锅和羽绒服,很多奋斗在科研一线的小伙伴还会选择到实验室避寒,不只是因为实验室的暖气最足,毕竟理想的实验结果出来才是对我们最大的安慰( •̀∀•  )。好不容易完成了组织分离,核酸提取,文库构建,终于到了最关键的一步——上机测序。不少小伙伴会有疑问:什么样的文库是符合上机要求的呢?质检报告会提供哪些信息?Illumina平台是怎样测序的呢?想知道答案,就快来看看小编为您准备的NGS文库测序攻略吧~


1539741011618493.jpg1. 送样篇

Q:什么样的文库是符合上机要求的呢?

A:首先需要确认文库的机构是否符合Illumina平台的上机要求,其次文库的片段大小、体积、浓度等需要符合相应平台的上机标准。安诺基因拥有HiSeq X Ten、NovaSeq 6000、NextSeq 550AR以及MiSeq测序平台,能够为您提供合适的测序策略,满足您多样的需求。我们列出了不同平台的上机标准,您还可以联系各地区的销售经理获取详细的送样建议。


表1 HiSeq X/NovaSeq 6000平台上机文库标准

表1 HiSeq X/NovaSeq 6000平台上机文库标准


表2 NextSeq 550AR/MiSeq平台上机文库标准

表2 NextSeq 550AR/MiSeq平台上机文库标准


1539741011618493.jpg2. 质检篇

Q:文库如何进行质检?质检报告会提供哪些内容呢?

A:上机之前,我们会使用Agilent 2100 或 LabChip GX Touch 生物芯片分析系统检测文库片段大小,并使用StepOnePlusTM Real-Time PCR System 进行 QPCR,对文库的有效浓度进行定量,并在质检报告中判定该文库的片段大小和浓度是否符合上机要求。

Q:文库质检不合格的原因有哪些?会造成什么影响?有哪些解决方案?

A:常见的文库质检不合格原因:


1)浓度低

影响:浓度偏低的文库可能定量不准,影响该文库的产出;在与正常文库pooling时,可能导致pooling后的浓度达不到上机要求,影响整条lane的产出。

解决方案:提高建库起始量和纯化回收效率,或适当增加建库过程中扩增循环次数,但是增加扩增次数也会导致dup率增加。


2)二聚体污染

影响:非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。此外,二聚体的优势扩增会导致整条 lane 文库有效数据产出偏低,影响 clean reads 的比率。



图1 二聚体污染

图1 二聚体污染

解决方案:适当减少建库过程引物用量;调整文库纯化时磁珠的比例。


3)小片段污染

影响:非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。此外,小片段的优势扩增会导致同一条 lane 其它文库产出偏低,接头污染 reads 增多,影响 clean reads 率,影响有效数据比例。


图2 小片段污染

图2 小片段污染


解决方案:优化片段打断和文库纯化条件,如果小片段是目的片段,可以包lane测序,并选择较短的测序读长。


4)大片段污染

影响:首先非目的片段会给文库的定量带来误差,影响文库产出。其次文库片段偏大,成簇时可能会跨孔长簇,这部分数据会被仪器过滤掉,影响数据产出。此外,较长的文库片段也会形成较大的簇,会导致荧光信号减弱,机器在碱基识别时,准确率降低,Q30 降低,同时也会影响数据量。


图3 大片段污染

图3 大片段污染

解决方案:优化片段打断条件。


5)二峰图过宽

影响:峰图过宽会给文库的定量带来误差,影响文库产出。且文库片段分布偏大或偏小会影响数据产出和Q30,可参考小片段污染和大片段污染。

解决方案:优化片段打断和文库纯化条件。


1539741011618493.jpg3. 测序篇

Illumina平台的核心原理是边合成边测序。在测序的过程中,Read1、Index7、Read2的测序引物依次与模板结合。以HiSeq X平台PE150试剂为例,如果只有P7端存在8位Index,那么测序时Read1+Index7+Read2的反应数是150+8+150 cycles;如果需要测8位的Index7和Index5,测序的顺序就是Read1+Index7+Index5+Read2,反应数为150+8+8+150 cycles。需要注意的是HiSeq X平台在对文库的Index7和Index5测序时,模板链是反向互补的,而NovaSeq 6000平台对双端Index测序时模版链则是同一条,也就是说同样的Index5序列在不同平台上测到的序列可能是反向互补的,因此在填写Index序列时需要选择测序平台对应的序列。


近期,我们推出了全新的快速周期产品:NovaSeq S4试剂单一文库包lane测序,从样本接收到云交付仅需3天,硬盘交付仅需4天HiSeq X单一文库包lane测序6个自然日即可交付结果。希望以上的分享能够对各位老师有所帮助,文库送到安诺了,实验结果的春天还会远吗~


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