单细胞转录组测序技术平台大PK
2018.11.15

随着方法的稳定及实验平台的不断进步,单细胞转录组测序已成为目前最炙手可热的科研技术之一。从最初的人工操作方法,到现在大热的高通量大规模平台,科研工作者可以根据不同的研究目的,利用各个层面的技术来深入挖掘细胞异质性。那么,现有单细胞转录组测序技术平台到底孰优孰劣呢?今天,小编就给大家来一场大PK。


单细胞测序技术发展

单细胞测序技术发展[1]


 Single Tube人工操作法


Single Tube人工操作法即在完成单个细胞的分选后,利用Smart-seq2原理进行mRNA全长扩增及建库,完成单细胞样本的上机测序分析。


Smart-seq2扩增建库原理

Smart-seq2扩增建库原理[2]


对于Single Tube人工操作法来说,难点在于细胞的分选。常见的细胞分选方法包括显微操作法、激光显微切割法、流式细胞分选(FACS)等。显微操作法是通过镜检,对单个细胞进行人工挑选的方法,可准确获取形态完整的活性较高的单细胞,但对操作人员技术要求高且通量较低。激光显微切割适用于组织样本的细胞分选,但操作中包括固定染色等步骤,会对核酸产生潜在的损害。流式细胞分选(FACS)通量较高,实验要求有稳定可用的荧光标记或荧光染料,需制备一定量的细胞悬浮液,不适用于微量样本。


小结

优点:Single Tube人工操作法有多种分选方法可选择,对样本需求量较低;质控点多,可从实验的开端判断细胞状况;获得mRNA全长数据,基因检出率高。

缺点:人工技术要求较高;通量低、成本较高。

适用范围:微量细胞样本(如胚胎细胞样本、ctc等),适用于深入研究。


 微孔板技术平台


微孔板技术平台利用大量的微孔完成细胞的捕获,随后进行单细胞转录组文库的构建。以浙江大学郭国骥老师团队自主研发的Microwell-seq为例,该技术通过琼脂糖微孔板捕获细胞,每个微孔板包含10万个微孔,能同时捕获约5千至1万个单细胞。通过镜检,用毛细管去除单一微孔的多余细胞,提高单细胞捕获率。随后加入带有barcode的磁珠,同捕获的单细胞相结合。裂解液加入后,结合不同磁珠的细胞被转移到1.5mL管里,进行后续反转录、扩增及3’端建库测序。


Microwell-seq技术流程

Microwell-seq技术流程[3]


小结

优点:微孔板技术平台成本低,通量高;可通过镜检进行细胞质控;平台较为开放,利于个性化研发。

缺点:对细胞总量要求较高;为3’测序,基因检测率不及Single Tube人工操作法;操作步骤较多。

适用范围:大规模细胞样本(组织消化样本、细胞系等),适用于分群研究。


 微流控技术平台


微流控分选基于流体力学原理实现细胞分选,适用于高通量、大规模的单细胞研究。近期大热的10xGenomics ChromiumTM平台就是利用该原理进行单个细胞分选。其技术核心是含有75万种barcode的油滴包裹的凝胶珠(GEMs),能在10分钟内自动完成多至80,000个细胞的捕获,后续还包含配套的扩增建库试剂盒,以及较成熟的官方生信分析流程。


10xGenomics技术流程

10xGenomics技术流程[4]


小结

点:微流控技术平台成本低,通量高;操作简便。

缺点:对细胞总量及活性要求较高;3’测序,基因检测率不及Single Tube人工操作法;缺乏质控点;平台环境较为封闭,个性化研发成本较高。

适用范围:大规模细胞样本(组织消化样本、细胞系等),适用于分群研究。


看完小编的总结后,大家不难发现,目前各种单细胞转录组技术平台,各有利弊,并不存在绝对完美的技术,对于研究者来说,可根据不同的科研需求及样本实际情况综合考虑,选取最优的方案


作为国内单细胞测序技术整体解决方案的测序服务提供商,目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品,覆盖三大组学(基因组、转录组、表观组),拥有丰富的项目经验、合作单位100+、物种经验50+、多篇高分文章IF累计100+,能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略,使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。


安诺单细胞测序产品


参考文献

[1] Svensson V, Vento-Tormo R, Teichmann S A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade[J]. Nature Protocols, 2018, 13(4):599-604.

[2] Picelli S, Faridani O R, Björklund A K, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols, 2014, 9(1):171-181.

[3] Han X, Wang R, Zhou Y, et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq[J]. Cell, 2018, 172(5):1091.

[4] Zheng G X Y, Terry J M, Belgrader P, et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells[J]. Nature Communications, 2017, 8:14049.


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