头条!安诺表观测序助力卵母细胞甲基化组研究登顶Nature
2018.12.20


中国科学院生物物理研究所朱冰研究员课题组首次报道了Stella可通过抑制DNMT1介导的起始性DNA甲基化来控制卵母细胞的甲基化组,研究成果见刊Nature安诺基因参与了本研究的高通量测序相关工作,为这一教科书级别研究添砖加瓦


高等动物的新生命起始于两性配子结合形成的单细胞合子。个体继承父母的DNA序列所编码的生命密码,同时获得两性配子基因组的表观遗传修饰特征,这些特征对胚胎早期发育具有重要影响。从雌性个体出生到最终形成卵子,卵母细胞会经历复杂的成长过程,其中伴随着DNA甲基化水平的逐步增加,而起始性DNA甲基转移酶(de novo DNA methyltransferase,DNMT)家族在其中起到主要作用[1-2]。不同于大多数细胞在转录沉默区域具有较高的DNA甲基化水平,卵母细胞的转录沉默区域会呈现低甲基化水平[3-4],这一特征的产生机制及其对早期胚胎发育的影响尚不明了。


考虑到卵母细胞独特的甲基化模式,在其成长中调控甲基化水平的相关基因也受到广泛关注。Stella(也被称为Dppa3PGC7)是近年来研究热度颇高的母体效应相关基因之一,在生殖细胞和着床前的胚胎中特异性表达[5-6]。Stella蛋白与UHRF1存在很强的相互作用,而后者会结合DNA并募集DNMT家族的甲基转移酶。有研究显示,体细胞中过表达的Stella能抑制UHRF1-DNMT1组成的甲基化酶体系,导致DNA去甲基化水平提高[7]。但Stella及UHRF1、DNMT1在卵母细胞成长以及胚胎早期发育中对基因组甲基化水平的影响如何,一直以来都欠缺完整的研究。


近期,发表于顶尖期刊Nature的一项研究揭示了Stella可以影响UHRF1的细胞内定位并干扰卵母细胞及合子的DNA甲基化情况,第一次提供了DNMT1在体内存在起始性DNA甲基转移酶活性的证据[8]。这项研究由中国科学院生物物理研究所朱冰研究员课题组主导完成。


发表于Nature期刊


考虑到Stella对UHRF1的互作关系,研究者首先利用免疫染色法检测了卵母细胞中Stella对UHRF1空间定位的影响。Stella在初生雌性小鼠卵母细胞中呈均匀分布,而出生20天后在细胞核相对富集;与此相对,UHRF1在同一时期主要定位于细胞质。突变敲除Stella后,UHRF1在早期聚集在细胞核,出生20天后仍有相当一部分在核内,这表明Stella对UHRF1向细胞质的运输具有重要影响。研究者之后在细胞中外源表达野生型Stella、与UHRF1亲和力低的突变型Stella、出核信号异常的突变型Stella,同时还用出核抑制剂来处理细胞。结果显示,只有未被出核抑制剂处理、表达野生型Stella的细胞中,UHRF1才能正常定位在细胞质中,这证明Stella是招募UHRF1出核的重要元件


Stella表达时UHRF1定位的差异


Stella缺失时UHRF1定位的差异

Stella表达(上)和缺失(下)时UHRF1定位的差异[8]


考虑到UHRF1对DNA甲基化的调控作用,研究者接下来利用基于高通量测序的RRBS技术对不同时期卵母细胞的基因组甲基化水平进行了检测。在缺失Stella的卵母细胞中,基因组CpG位点甲基化水平相比Stella表达正常的卵母细胞会在发育后期具有显著的上升;而Stella缺失个体的精子基因组甲基化水平并未变化,其生殖能力也不受影响。卵母细胞基因组中新出现的超甲基化区域包括多种重复序列和多数发育相关基因,而在母系或父系印记基因的差异甲基化区域(DMR)的DNA甲基化基本是正常的。这表明,在卵子形成中Stella是正确建立卵母细胞甲基化组所必需的


通过对比早晚期卵母细胞的甲基化组,研究者定义了卵母细胞获得性甲基化区域(ooAMRs)。缺失Stella的卵母细胞相比正常卵母细胞有大量额外ooAMR存在。但在Stella与UHRF1双敲除小鼠中不存在这些额外ooAMR,甲基化水平与正常小鼠相近。由此来看, Stella是通过限制UHRF1参与的起始性甲基化过程来防止卵母细胞过度甲基化。


Stella缺失带来的甲基化组改变对胚胎发育具有重大影响。研究者发现,超过半数Stella敲除卵子与正常精子形成的胚胎停滞于2细胞期向4细胞期的转变过程中,能发育至囊胚期的不足15%,表明Stella缺失引发的UHRF1异常会导致胚胎发育缺陷。对受精后合子的RRBS检测显示,在Stella缺失母方的雌原核中额外ooAMR的去甲基化水平很低,这甚至会影响雄原核的正常去甲基化,导致整个合子基因组超甲基化,进而改变合子基因组激活(ZGA)基因的表达水平,特别是其中来自母方的ZGA基因表达。


在以往研究中,通常认为DNMT3A在起始性甲基化过程中起到作用。因为缺少作为起始性甲基化酶的直接证据,DNMT1往往被认为是维持性甲基转移酶。但在本文中,研究者观测到Stella缺失卵母细胞中DNMT1定位于UHRF1的富集区,但未发现DNMT3A的亚细胞定位发生。这促使他们进一步验证DNMT1和DNMT3A在基因组甲基化特征变化过程中起到的作用。通过分别敲除DNMT1和DNMT3A,研究者发现DNMT3A在对照组卵母细胞的甲基化组建立中起到主导作用;但在Stella缺失卵母细胞的异常甲基化区域中81%依赖于DNMT1,受到DNMT3A影响的仅3.8%。特别是在Stella和DNMT3A双敲除的卵母细胞中,其基因组整体甲基化水平甚至高于对照组。这些证据综合起来,第一次系统而充分地证明了DNMT1在体内具有很强的起始性甲基化酶活性


UHRF1和DNMT1的共定位

UHRF1和DNMT1的共定位[8]


DNMT3A与DNMT1各自对卵母细胞基因组甲基化的影响

DNMT3A与DNMT1各自对卵母细胞基因组甲基化的影响[8]


在研究基因组DNA的甲基化情况过程中,研究者利用了多种基于高通量测序及质谱法的甲基化检测技术,保证了结论的严谨性。安诺基因有幸承担本研究主要的高通量测序相关工作,为这一教科书级别研究添砖加瓦。安诺基因目前提供全面的表观基因组测序服务,包括WGBS、scWGBS、MeDIP-seq、ChIP-seq和ATAC-seq等多项技术,满足各位科研工作者的不同研究需求~


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参考文献:

[1] Shirane K, Toh H, Kobayashi H, et al. Mouse oocyte methylomes at base resolution reveal genome-wide accumulation of non-CpG methylation and role of DNA methyltransferases[J]. PLoS Genet, 2013, 9(4):e1003439.

[2] Smallwood S A, Tomizawa S, Krueger F, et al. Dynamic CpG island methylation landscape in oocytes and preimplantation embryos[J]. Nat Genet, 2011, 43(8): 811-4.

[3] Stewart K R, Veselovska L, Kelsey G. Establishment and functions of DNA methylation in the germline[J]. Epigenomics, 2016, 8(10): 1399-1413.

[4] Kobayashi H, Sakurai T, Imai M, et al. Contribution of intragenic DNA methylation in mouse gametic DNA methylomes to establish oocyte-specific heritable marks[J]. PLoS Genet, 2012, 8(1): e1002440.

[5] Sato M, Kimura T, Kurokawa K, et al. Identification of PGC7, a new gene expressed specifically in preimplantation embryos and germ cells[J]. Mech Dev, 2002, 113(1): 91-4.

[6] Saitou M, Barton S C, Surani M A. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice[J]. Nature, 2002, 418(6895): 293-300.

[7] Funaki S, Nakamura T, Nakatani T, et al. Inhibition of maintenance DNA methylation by Stella[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,453(3): 455-60.

[8] Li Y, Zhang Z, Chen J, et al. Stella safeguards the oocyte methylome by preventing de novo methylation mediated by DNMT1[J]. Nature, 2018, 564(7734): 136-140.


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