你问我答篇-人基因组测序送样问题
2019.03.01

人基因组测序的样品类型繁多,每种类型的样品准备都是有讲究的,一旦没有正确送样,就会付出惨痛的教训。不仅耽误实验进程,还浪费了珍贵样本,送样不规范,科研两行泪。今天小编就给大家讲讲人基因组测序送样的“弯弯道道”~ 让大家在后续实验中能够“快、准、狠”地一次搞定送样。


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送样中低温冻结、导致无法提取cfDNA的血液



人基因组测序的样本类型大致可分为四大类:血液、组织、细胞、核酸。不同的样本类型送样要求也不尽相同,下面分别来介绍。



血液样本


在疾病研究过程中,血液样本由于易采集而被广泛使用,在实体瘤研究过程中也可作为对照样本,可谓是基因检测过程中的“模式样本”。


Q:为什么用血液样本做ctDNA测序需要常温运输?

A:循环游离DNA(cfDNA)是游离在血液中的来自体内细胞或者白血球破裂释放的DNA,ctDNA是cfDNA中来源于肿瘤的部分,在血液中含量很少。如果将血液冷冻后再解冻,会使血细胞破裂,释放大量的gDNA,从而污染cfDNA,无法进行后续的提取。



Q:只有分离后的血浆,可以做ctDNA测序吗?

A:血浆可以用于ctDNA测序。由于ctDNA是游离在血液中的DNA,离心去除血细胞后,剩余的部分含有ctDNA。由于没有血细胞的存在,更适合低温冷冻运输。



Q:为什么不能用肝素抗凝管来收集血液后期再做基因组测序?

A:使用肝素抗凝管收集血液会导致细胞裂解不充分,提出来的DNA杂质较多。而且肝素会抑制酶的活性,对后续的PCR反应有较强的抑制作用,因此不建议用肝素抗凝管来收集血液做基因组测序。


血液样本送样要求




组织样本


在癌症研究过程中,由于肿瘤的异质性,一般会选择肿瘤组织样本进行基因检测,组织样本又可分为新鲜组织样本和福尔马林固定、石蜡包埋的组织样本(FFPE)。



新鲜组织样本


Q:为什么要用PBS清洗组织?

A:样本中的血液残留会影响后期的DNA提取质量,因此需要尽量洗去血渍。



Q:癌症研究为什么一定要送对照样本?

A:为了调取肿瘤组织中的体细胞突变,需要选择血液或者癌旁作为对照从而排除胚系突变。



Q:500 mg组织大约尺寸是什么样的?

A:一般来说,500 mg的新鲜组织大约有半颗花生米大小。



新鲜组织送样要求


 

石蜡包埋组织样本(FFPE)


Q:考虑到后续的测序需求,FFPE样本包埋过程中需要注意哪些事项?

A:FFPE样本制备过程对于测序结果影响很大,以下几点可以有效优化:

a 从取下组织到完成包埋所用时间尽可能短;

b 取样量越多越好;

c 取样时避免混入脂肪组织;

d 包埋试剂的PH值尽量接近中性。


Q:FFPE样本需要提供哪些样本信息?

A:除常规的样本命名、性别、组织类型等,还必须注明切片年限,必须提供HE染色切片或者HE染色切片的检测报告/图片,并注明需要取用的部分。



石蜡包埋组织样本送样要求



细胞样本



对于体外培养的细胞,也可以选择寄送细胞样本。



Q:悬浮细胞和贴壁细胞处理方法一样吗?

A:考虑到培养方式差别,收集细胞的过程也有所不同:

1)悬浮细胞:悬浮细胞培养结束后,离心去除培养液;收集的细胞用PBS缓冲液快速洗2次,低速离心除去PBS缓冲液。

2)贴壁细胞:贴壁细胞培养结束后,吸取去除培养液,胰酶消化,用PBS缓冲液快速洗2次并收集洗下的细胞;低速离心除去PBS缓冲液。



细胞样本送样要求



核酸样本



除了上述提到的样本类型,也可以直接寄送提取得到的核酸样本,收到样本后会进行质检。



Q:为什么需要用Qubit检测DNA浓度?

A:Qubit荧光计采用荧光染料检测特定目标分子的浓度,只有与特异性的靶分子结合时,才能发出荧光信号。它特异性的检测靶分子(DNA)而不包含污染物(RNA、蛋白)的浓度,结果较分光光度计更准确。



Q:如果DNA样本检测纯度不在1.8-2.2范围内,怎么处理?

A:OD260/280 < 1.8表明样本有蛋白、酚等污染,OD260/280 > 2.2表明样本有RNA污染,可进一步纯化或加入RNA降解酶。



核酸样本送样要求


 

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