安诺Hi-C辅助组装合作文章再登Nature Communications
2019.04.08

An apple a day keeps the doctor away,很多人都喜欢吃苹果,吃的时候你想过为什么苹果会有不同的颜色吗?小编都没想过原来果皮颜色不同还是一个重大的科学问题。就在前日,中国农业科学院果树研究所丛佩华研究员课题组在Nature Communications在线发表了题为A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour 的文章,揭示了转座子和红色果实颜色的相关性。在本研究中,安诺优达承担了Hi-C辅助组装分析工作。

 

该研究通过联合使用PacBio单分子实时(SMRT)技术,染色体构象捕获技术(Hi-C)和光学图谱技术,组装了苹果花药来源的纯合系HFTH1的染色体级别的高质量基因组(基因组大小为658.90 Mb, contig N50为6.99 Mb,17条染色体)。与金冠参考基因组比对,在HFTH1基因组中鉴定了18,047个缺失,12,101个插入和14个大的倒位。研究揭示这些变异主要是由转座子引起,其中研究发现长末端重复(LTR)逆转录转座子插入MdMYB1的上游,它是花青素生物合成的核心转录激活因子,与红色果皮表型相关。


基因组组装和评估


为降低组装复杂度,使用花药来源的三倍体寒富系苹果(HFTH1)进行基因组测序,其供体寒富是高度杂合的二倍体栽培种。微卫星标记、k-mer分析、流式实验证实HFTH1基因组为纯合三倍体,表明HFTH1在体外培养期间经历了自发的染色体重复。与最近发表的双单倍体金冠系基因组相比(GDDH13),HFTH1更纯合,更有利于改善基因组组装质量。


本研究对HFTH1基因组进行了PacBio三代测序,二代测序,光学图谱和Hi-C测序。利用PacBio三代数据组装基因组,二代数据纠错,随后使用光学图谱数据将基因组提升到scaffold水平。最后,利用Hi-C数据进行准确聚类、排序和定向,组装出658.90 Mb基因组,17条染色体,22条长的端粒序列,contig N50为6.99 Mb,接近k-mer分析预估的HFTH1基因组大小(708.54 Mb)。BUSCO评估完整性为97.0%,EST评估编码区完整性为98.02%,确认该基因组组装的高完整性和准确性。



图1 HFTH1基因组Hi-C辅助组装结果展示[1]

图1 HFTH1基因组Hi-C辅助组装结果展示[1]



基因组注释


文章共鉴定了44,677个高可信度蛋白质编码基因,注释基因覆盖了95.9%的完整BUSCO基因,约92.28%的注释基因在至少一个组织中表达或与已知蛋白同源,表明基因注释非常完整。文章结合从头和基于同源法来注释重复序列。在HFTH1和GDDH13基因组中分别鉴定了约393.88 Mb和362.18 Mb转座子(TE)。



寒富与金冠比较基因组分析


寒富与金冠具有明显不同的表型,包括红皮,强抗寒性,抗叶斑病,抗枝条腐烂,果实耐贮性等。通过SNP和GDSV分布的全基因组图谱,GDSV和SNP相关基因的富集分析结果一致,均与抗病结构域显著相关。超过70%的GDSV与TE相关,且寒富与金冠的TE分歧率存在显著差异。此外,文章共鉴定了18,047个缺失和12,101个插入,包括14个长度超过100 Kb的大片段插入变异(INV),其中两个超过600 Kb,并且这两个INV的所有断点都位于TE元件内,提示可能是TE导致了插入变异的产生。



逆转录转座子作为MdMYB1表达的增强子


文章通过组装的基因组来研究重要农业性状,专注于研究苹果果实的红色表型。遗传证据表明,MdMYB1是花青素生物合成途径的核心转录调控基因,调控红色表型。通过qRT-PCR检测到寒富和金冠成熟果皮中MdMYB1和花青素相关结构基因的转录水平之间存在显著差异。非红果实品种中的MdMYB1等位基因在强光和低温下表现出有限的表达。


文章在HFTH1和GDDH13基因组中进行了MdMYB1序列比对,结果显示MdMYB1的编码序列相同,但在HFTH1中,有一段4097 bp的插入,位于MdMYB1的ATG起始密码子上游3297 bp处,并且是具有两个TSD的gypsy式LTR反转录转座子(表示为redTE,CATAT)。为了研究redTE与红色果皮颜色的关联,本文通过redTE特异PCR标记筛选确定了112个具有已知表型的红果实种质和33个非红果实种质,结果显示,所有测试的红果实种质均含有redTE但在非红果实种质中未发现redTE。此外在红果实苹果Honeycrisp和非红果实苹果Huayue的后代F1中也表现出了redTE与红色果实性状的共分离,这些实验表明redTE插入可能是苹果红色表型的原因。进一步在烟草中进行瞬时转染实验检测redTE对荧光素酶基因表达的影响,结果表明redTE能够增强酶基因表达活性,提示redTE作为功能转座子发挥MdMYB1光响应基因表达的局部增强子功能。



图2 苹果的红色表型与LTR反转录转座子相关[1]

图2 苹果的红色表型与LTR反转录转座子相关[1]


该研究不仅揭示了苹果红色果实着色的遗传基础,且发布的染色体级别高质量基因组为苹果重要农业性状的研究和遗传育种提供了依据。

 

安诺基因作为国内优质的二、三代测序服务商,配备了PacBio Sequel、Hiseq X Ten、Novaseq 6000等全面的测序平台和一流的技术团队。安诺基因的特色产品Hi-C辅助组装技术目前已经累计发表商业合作文章4篇,影响因子近50在基因组组装方向,已积累100+项目经验,涉及林木、中草药、农作物、哺乳动物、昆虫、海洋生物等各个方向,部分相关研究成果已发表于Molecular PlantNature Communications等国际高水平期刊,累计IF 130+。欢迎感兴趣的老师前来咨询~

 

参考文献:

[1] Liyi Zhang, Jiang Hu, Xiaolei Han, et al. A high-quality apple genome assembly reveals the association of a retrotransposon and red fruit colour[J]. Nature Communications. 2019.04.02.



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