避免宏基因组研究设计雷区,只需10分钟!
2018.09.14

在这组学研究火热的时代,宏基因组学作为后起之秀,经“大牛”们一番打扮,便华丽丽的登上了科研舞台,其在医学领域、环境领域的出色表演,已然受到研究者的追捧和关注,然而宏基因组的研究对象大多为复杂环境样本,这会让研究者们在不经意之间进入“雷区”,然后被炸得体无完肤。其实“扫雷”大牛们,已亲身犯险,为我们标记了宏基因组研究设计的“雷区”。


1. 如何设计严谨的方案,确定样品测序深度


检测显著差异所需的样本数量和测序深度取决于不同样品间微生物组成的一致性、样品的菌群多样性以及研究现象的影响大小等因素。

解决方案

1. 查阅已发表的相同研究样品的文章作参考;

2. 如无参考,则需要谨慎进行初步的基于基因标记的研究以评估所列出的每一个因素的相对影响。


2. 如何选择对照组、排除干扰因子


复杂环境样品(土壤、肠道等)存在大量的干扰因子,其对照组很难获得,例如啮齿动物微生物的研究,饲养环境和批次等都会导致微生物组成的显著差异;再例如对疾病相关微生物的横向研究中,如无积极治疗,则病人无法取样。

解决方案目前的最佳方法是尽可能多的收集每个研究组的表型数据,并在比较时将这些表型数据考虑到分析中。对于临床样品,通常包括性别、年龄、抗生物/药物使用、区域、饮食习惯、布里斯托大便分类法(Bristol Stool Scale)等。对于环境样品,通过包括地理位置、季节、PH值、温度等相关参数。Laukens等对啮齿动物微生物组的研究提供了进一步的建议[1]。在一些纵向变化可与相关表型数据相关联时,来自相同病人/位置的纵向取样可作为额外对照组。


3. 如何采集和保存样品


以完全相同的方式处理和保存所有样本很困难(例如,多地点取样);纵向研究中,最后取样时间点收集的样本在DNA提取前的冷储时间可能少于其它样本。这种采样和保存过程的改变可能会导致分类的偏好。

解决方案尽可能的对一个研究中的所有样品进行标准化收集和保存。在进行后续数据分析时,应记录每一步过程,并将其作为表型数据。这些数据包括收集和DNA提取之间的时间、冷储时间以及冻融循环次数等。例如,甘油中保存的哺乳动物肠道样本在长期冻存后会产生更典型的组成结果[2]。同样,冷冻干燥保存也是如此。

4. 如何避免样品污染?


基于测序技术的超高敏感性,极低量的DNA便可满足测序,但是普通的实验室工具和试剂并不是无菌的,这意味着样品中所含的任何污染都有可能掩盖样本中低丰物种“真实”信号[3]

解决方案qPCR定量之前,需测量样本中的微生物水平。含有少于105个微生物数量的样本会受到背景污染的极大影响[4]。用处理实验样品相同的试剂盒/试剂同样处理阴性对照样品,然后通过测序来确定污染微生物的种类,数据过滤时将污染微生物的序列数据移除。另外,阴性对照的敏感性可通过载体DNA增强[5]


5. 如何选择DNA提取方法


这一步骤会极大的影响宏基因组的研究结果。如果提取方法不严格,某些类型的微生物DNA则无法提取,会直接影响序列数据组成。从根本上说,最优DNA提取方法取决于既定样本中存在的微生物类型。但同类型样品中的微生物类型可能有很大的差异,例如不同的人的粪便中G+细菌和G-细菌的比例不同。因此,任何一种DNA提取方法对所有样本类型都不是最优的。

解决方案使用给定环境中常见的物种类型混合而成的培养菌作为模拟菌群对照,是测试不同DNA提取方法有效性和准确性的标准[6]。模拟菌群可通过研究样本类型中普遍存在的物种多样性收集来优化。然而,利用简化模型来模拟真实微生物菌落的复杂性是很困难的,而且不能测试未知/未培养微生物的提取效率。大量证据表明,DNA提取过程中加上磁珠震荡步骤可提高微生物组的DNA提取量和代表性[7,8]。然而,这种方法通常会因DNA太过碎裂而限制长读长测序技术的应用。


图1 宏基因组学研究设计流程示例


安诺基因依托强大的测序平台,已积累数千例样本项目经验,50余种样本类型提取经验,涉及土壤、湖泊、人体肠道、动物肠道、口腔、海洋、污水水体及其沉积物等样本,更有北极、海底沉积物等极端环境样本。可以自信的说,微生物组的研究,只有选择安诺基因,才不会后悔!


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图2 公司优势


参考文献

[1]. Laukens,D., Brinkman, B. M., Raes, J., De Vos, M. & Vandenabeele, P. Heterogeneity of the gut microbiome in mice: guidelines for optimizing experimental design. FEMS microbiology reviews, fuv036 (2015).

[2]. McKain,N., Genc, B., Snelling, T. J. & Wallace, R. J. Differential recovery of bacterial and archaeal 16S rRNA genes from ruminal digesta in response toglycerol as cryoprotectant. Journal of microbiological methods 95, 381-383(2013).

[3]. Kia,E. et al. Integrity of the Human Faecal Microbiota following Long-Term Sample Storage.  PloS one 11, e0163666 (2016).

[4]. Salter,S. J. et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence based microbiome analyses. BMC biology 12, 87 (2014).

[5]. Xu,Z. et al. Improving the sensitivity of negative controls in ancient DNA, extractions. Electrophoresis 30, 1282-1285 (2009).

[6]. The Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214 (2012).

[7]. Yuan,S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z. & Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PLoS One7, e33865 (2012).

[8]. Gerasimidis,K. et al. The effect of DNA extraction methodology on gut microbiota research applications. BMC Research Notes 9, 365(2016).



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