叮咚!您有一份10x Genomics单细胞测序上样建议请查收~
2019.10.31

时下最火的测序技术当属单细胞测序,其中10x Genomics平台无论从通量、成本、稳定性各方面来说都占据着很大的优势。10x Genomics平台基于微流控原理进行单细胞分选,对于上机样本从质量及总量上,都有一定的要求,能否尽可能贴合上机要求往往就是实验成败的关键今天小编就为大家整理了10x 单细胞测序各种测序策略上样建议大全,干货满满哦!


10x Genomics 单细胞转录组


主要样本类型

新鲜细胞悬浮液


细胞重悬Buffer要求

必须不含钙镁离子和EDTA,可使用DPBS或其它合适的缓冲液/培养基。


细胞数量要求

1. 细胞总量:>10倍目标捕获细胞数。

2. 细胞浓度:须调整在700-1,200个细胞/μL浓度范围内,以便样品直接用于质检和上机。


细胞质量要求

1. 样本中活细胞百分比率大于90%。

经染色法细胞计数检测结果判断,人工计数使用台盼兰染料,细胞计数仪计数可使用AO/PI荧光染料活台盼兰染料。

2. 无大于40 μm的细胞碎片、组织碎片、纤维灰尘等各类杂质,总杂质含量经估算应<5%。

可使用40 μm细胞滤网进行过滤除杂,杂质较多且细胞数充足前提下可进行多次过滤。

3. 细胞呈单分散状态,细胞结团率<5%

Buffer/培养基中添加BSA/血清可提供一定的抗结团作用,必要时应使用宽口吸头进行轻缓吹打使细胞分散。

4. 细胞悬浮液中不含逆转录抑制剂成分,不含游离核酸。

将细胞由含钙镁离子或EDTA的Buffer/培养基转入不含钙镁离子或EDTA的Buffer/培养基中时,应对细胞进行清洗和离心收集至少两次,以保证干净去除这些反应抑制剂和游离核酸;操作过程中应尽量保证细胞活性和缩短操作时间,避免细胞边处理边死亡造成游离核酸不断释放。



10x Genomics ATAC


主要样本类型

新鲜细胞核悬浮液


细胞核重悬Buffer要求

必须重悬于当天新鲜配制的Nuclei Buffer(官方提供)中。


细胞核数量要求

1. 细胞核总量:>35,000个细胞核。

2. 细胞核浓度:3,080-7,700个细胞核/μL。


细胞核质量要求

1. 样本中活细胞百分比率大于90%。

经染色法细胞计数检测结果判断,人工计数使用台盼兰染料,细胞计数仪计数可使用AO/PI荧光染料活台盼兰染料。

2. 无大于40 μm的细胞碎片、组织碎片、纤维灰尘等各类杂质,总杂质含量经估算应<5%。

3. 细胞核呈单分散状态,结团率<5%。

4. 细胞核悬浮液中不含转座反应抑制剂成分,不含游离核酸

对细胞核进行清洗时应注意离心条件的优化,避免造成细胞核数量损失;操作过程中应尽量轻缓和缩短操作时间,避免造成游离核酸不断释放。

5. 使用高倍物镜(40x 或60x)对所得细胞核进行观察质检,细胞核膜应无破裂,光滑圆润


10x Genomics Feature Barcode蛋白组&转录组


主要样本类型

新鲜细胞悬浮液


细胞重悬Buffer要求

必须不含钙镁离子和EDTA,可使用DPBS或其它合适的缓冲液/培养基。


细胞数量要求

1. 细胞总量:至少1.5x106个细胞。

注意一般1x106个细胞对应抗体-核酸使用量为1 μg,另0.5x106细胞用于细胞计数和活性检测。

2. 细胞浓度:需根据具体选用抗体-核酸的效价/用量,调节为适宜浓度。


细胞质量要求

可参考上文10x Genomics 单细胞转录组细胞质量要求。



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