这些lncRNA二代测序问题肯定困惑过你
2018.03.14

众所周知lncRNA堪称分子界的一股“泥石流”,左右逢源,可分别与DNA,RNA,蛋白质发生相互作用,从而发挥转录组调控或转录后调控。近年来研究人员对lncRNA的关注度仍是热火朝天,2017年发表lncRNA相关的文章高达2748篇,而今年1月就已经发表380篇,预示着lncRNA在2018年还会大爆发。


值此新春开学季,安诺学院迎来了节后第一批学员,为了帮助学员们更好的掌握lncRNA测序相关信息,在学院里开展了关于lncRNA专题研讨会,研讨会直播盛况如下:

image.png

小安老师,请问做lncRNA测序前需考虑什么问题?

image.png

小甲同学你这个问题非常好,在做lncRNA测序之前,除了生物学重复,样品设置等基本问题需要考虑外,有两个关键点是我们必须要注意的:


实验建库环节


是否有此物种rRNA去除的试剂盒(并不是所有的物种都已有成熟的rRNA去除试剂盒);


信息分析环节


是否有研究物种组装版本较好的参考基因组(建议染色体组装水平)及注释信息完整的注释文件。


安诺基因采用Illumina官方认可试剂盒(Ribo-Zero™ Gold Kits和

NEB Next Ultra Directional RNA Library PrepKit for Illumina)进行文库构建,项目经验丰富,包括人、鼠、拟南芥和水稻等,累计物种经验50+。

 Ribo-Zero™ Gold Kits有专门针对人,鼠,细菌,酵母,哺乳动物,植物根,叶片等设计的不同物种类别的rRNA去除试剂盒。


小安老师,那么lncRNA建库测序对样品有什么要求呢?

lncRNA测序样品重点关注其完整性,总量,浓度及纯度,要求如下:


样品类型

RNA类样品,完整且无外源污染


样品量

人、鼠类样品≥2µg,其他物种样品≥5µg


样品浓度

≥200ng/µl




另外,需注意培养的细胞类样品是否存在支原体污染,建议提前做好样品支原体污染检测,避免测序结果因支原体RNA数据残留,而影响数据质量及分析结果。

利用lncRNA测序技术可以挖掘哪些信息?

可以从两个方面分析这个问题。



实验角度


采用的文库是去除rRNA的链特异性文库,一次建库测序可同时获取mRNA,lncRNA及cricRNA的数据信息,可对原始测序数据进行充分挖掘,全方位研究分子调控机制等。


分析角度


可同时分析样本中的lncRNA和mRNA表达量,不仅可以鉴定特异表达的lncRNA和发现新lncRNA,更可开展后续关联性分析,靶标预测,深入挖掘基因调控机制,广泛应用于发育调控、疾病标记物的寻找、药物靶点筛选等领域。


1521014688161155.png

image.png

RNA-seq测序得到了显著差异表达的lncRNA,后续可设计哪些验证方法?

image.png

对于目标lncRNA验证可从多个层面开展,如基本的表达量验证,对lncRNA发挥的调控功能验证,或对其互作方面验证,具体方法可参考下图。


1521014701634895.png

image.png小安老师,如果lncRNA位于不同的细胞定位,在做基因沉默的时候应该用什么策略?image.png

lncRNA的作用机制非常复杂,如细胞核中的lncRNA可以通过直接与靶基因结合来激活或抑制靶基因的表达,还能通过参与组蛋白修饰或募集转录因子而参与基因的表达调控;而细胞质中的lncRNA则可通过ceRNA调控机制,参与靶基因的表达调控。


细胞定位对研究lncRNA功能来说至关重要,对于不同细胞定位的RNA分子,在做基因沉默时可采用的策略有:


1

当lncRNA位于细胞质的时候,用RNAi;

2

当lncRNA位于细胞核的时候,用寡核苷酸反义RNA(antisense oligonucleotides ,ASOs );

3

当lncRNA在细胞质和细胞核都定位的时候,两种方法都可以。

如何预测LncRNA的靶基因?

image.png

lncRNA具有复杂的作用模式,除顺式(cis)和反式(trans)作用外,还可与DNA、RNA和蛋白等不同的分子结合发挥作用,从转录及转录后水平发挥作用。


lncRNA的靶基因预测主要包含:


1

根据顺式(cis)的作用模式来预测;

2

根据lncRNA结合的核酸序列来预测,如预测工具lncRNATargets等;

3

根据蛋白的结合特性来预测,如预测工具RBPDB等。


小安老师,如果我想自行尝试对测序鉴定到的lncRNA进行分析,常用lncRNA有关的数据库有哪些,可否推荐一些呢?

如下表展示的是一些常用数据库,可根据每个数据库的特点,进行适当选用。


1521014719614498.png





以上就是本期安诺学院研讨的主要内容,你掌握了吗?更多精彩内容,敬请期待下期安诺学院精品课程。

 

安诺基因lncRNA测序拥有丰富的项目经验,全面的分析内容(多组学联合+ceRNA分析),更综合下游合作公司资源,涵盖lncRNA筛选、分子生物学鉴定、直接靶点筛查、生物学功能研究、lncRNA-蛋白-DNA/lncRNA-RNA等多项功能验证研究,为您提供全面的一站式服务!


文案:转录组产品经理 范如婷

设计:胡珊珊

在线客服

>>

安诺基因在线客服

客服1 客服2 客服3

电话:400-8986-980