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分子诊断: qPCR、二代测序NGS和数字PCR如何选?

2018-07-20 测序中国


分子诊断: qPCR、二代测序NGS和数字PCR如何选?

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分子诊断是将分子生物学技术应用于疾病诊断的医学分支学科,利用分子生物学技术研究人体内源性或外源性生物分子的存在、结构或表达调控变化,为疾病的预防、预测、诊断、治疗、预后和转归提供信息和决策依据。精准医疗的发展,将持续推动分子诊断的进步。目前常见核酸分子诊断技术涉及三个技术:荧光定量PCR技术(qPCR)、高通量测序技术(NGS)和数字PCR。如何选择,我们作一下简要介绍。

qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。

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NGS可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。在基因组水平上,NGS可进行从头测序而获得该物种的全长序列,为后续研究奠定基础;对已知参考序列的物种,进行全基因组重测序可检测新的突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上,NGS可进行全转录组测序,开展可变剪接、基因表达差异、新非编码RNA分子发现等研究。NGS与染色质免疫共沉淀和甲基化DNA免疫共沉淀技术相结合,可检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。NGS功能强大,适合用于探索筛选新的生物标志物,但是实验操作较复杂,数据分析难度较大,检测周期长,成本较高。

数字PCR是新兴起来的一种核酸分子绝对定量技术。该技术可直接获得DNA分子的拷贝数,实现起始样品中核酸分子的绝对定量,且无需标准品或内标。数字PCR已经被广泛应用到医学、生物学等各个领域,如拷贝数变异、突变检测、复杂来源样品中低丰度核酸分子检测、NGS数据验证、miRNA等微小差异表达研究、单细胞基因表达分析等方面,在已知突变的癌症分子标志物的检测、传染病病原体检测、基因组三倍体分析和基因表达分析等领域展现了强大的优势。

在实验过程中,大家会有疑问:选择哪种检测技术才能更好的达到预期结果?通过突变检测限、定量能力、操作简易程度、检测费用、适用场所、发现未知序列等方面进行比较,您或许会有自己的答案。

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从上表来看,数字PCR因为灵敏度高、绝对定量、适合于医院操作等优点,在肿瘤液体活检、无创产前筛查、感染性疾病早期诊断等临床检测应用方面具有显著优势。NGS在检测未知序列、未知突变、高通量多位点检测方面是更好的选择,是科研和独立实验室服务的好工具。qPCR适用于较常规的临床分子诊断项目。



文章来源于测序中国

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