必备!单细胞悬浮液制备指南
2018.11.30

时下最火的科研技术当属单细胞测序,而单细胞测序的一大难点在于细胞的分选。目前已有多种技术匹配不同的样本(干货~如何分选单细胞?),比如流式细胞分选以及微流控分选,都是高通量的单细胞分离技术,但这些技术对细胞悬浮液的总量以及活性都有一定的要求,因此制备高质量的单细胞悬浮液成为实验成功的关键点。今天小编就为大家整理了常见样本的单细胞悬浮液制备方法,干货满满哦!


PBMC

新鲜外周血收集于EDTA抗凝管,加入HISTOPAQUE-1077Sigma-Aldrich),离心后淋巴细胞位于血浆-HISTOPAQUE-1077的交界层,吸取淋巴细胞层于新管,用PBSInvitrogen)清洗细胞2次,重悬细胞可制得PBMC细胞(外周血单个核细胞)悬浮液[1]


脑组织

收集新鲜小脑组织于95% O25% CO2的人造脑脊液体中,分离组织并置于hibernate E mediumInvitrogen)中,加入BTDM12mg/mL collagenase IVGibco),10 U/μL DNaseINEB)进行消化。吹打组织使其分散成小块,加入BTDM21 mg/mL papainSigma)和10 U/μL DNase I再次消化,在37℃涡旋处理5min300g 离心5 min,放于冰上,弃掉上清,加入500 μL hibernate E medium轻轻重悬制得细胞悬浮液[2]


小肠组织

新鲜小肠组织分离后用冰冷的PBS冲洗,切成2mm长的小块,置于20 mM EDTA–PBS在冰上孵育90min,每30min晃动一次。而后晃动样本,收集上清。置换新鲜EDTA–PBS,继续孵育,每30min收集一次上清。最终的收集物用PBS清洗两次,300g离心3min,用TrypLE expressInvitrogen)于37℃处理1min,过40μm滤筛,制得单细胞悬浮液[3]


肝组织

将新鲜肝组织切成1mm3小块,在RPMI-1640 mediumInvitrogen)+10% FBS环境中于40mm细胞筛(BD)上用20mL注射器柱塞缓慢研磨,直至获得均一细胞悬浮液。细胞悬浮液逐步过筛,PBS清洗两次,400g离心10min,弃掉上清,加入red blood cell lysis bufferSolarbio)在冰上孵育2min破裂红细胞,PBS清洗两次,重悬制得细胞悬浮液[1]


动脉组织

动脉组织分离后,置于冰上 1mL RPMI mediaGibco)+10% FCS环境中,切成小块, 在包含450 U/mL Collagenase ISigma Aldrich)+250 U/mL Collagenase XISigma Aldrich)+120 U/mL HyaluronidaseSigma Aldrich)+120 U/mL DNaseIWorthington)的HBSS溶液中,37℃消化1h。之后悬浮液过40μm滤筛[4]


不难看出,各类组织制备单细胞悬浮液的方法都不尽相同,最适宜的制备方法往往需要摸索。目前,安诺单细胞团队助力广大科研工作者,已整理提供单细胞悬浮液制备参考文献30+,是您专业的样本制备顾问。如您需要特殊样本的细胞悬浮液制备参考,欢迎与当地销售经理联系,我们会给您提供一对一的专业服务。


安诺单细胞测序技术总览

安诺单细胞测序技术总览


作为国内单细胞测序技术整体解决方案的服务提供商,目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品,覆盖三大组学(基因组、转录组、表观组),拥有丰富的项目经验、合作单位100+物种经验50+、多篇高分文章(IF累计100+),能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略,使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。


参考文献

[1] Zheng Chunhong, Zheng Liangtao, Yoo Jae-Kwang, et al. Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing[J]. Cell, 2017, 169: 1342-1356.e16.

[2] Zhong Suijuan, Zhang Shu, Fan Xiaoying, et al. A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex[J] . Nature, 2018, 555:524-528.

[3] Haber Adam L, Biton Moshe, Rogel Noga, et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium[J]. Nature, 2017, 551(7680):333-339.

[4] Winkels Holger, Ehinger Erik, Vassallo Melanie, et al. Atlas of the immune cell repertoire in mouse atherosclerosis defined by single-cell RNA-sequencing and mass cytometry[J]. Circ. Res., 2018, 122: 1675-1688.


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