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技术简介


微生物群落多样性分析是利用二代高通量测序技术,对微生物的16S rDNA、18S rDNA以及ITS高变区域,分析环境中细菌、古细菌以及真菌的种类组成和结构,揭示环境样品中微生物种类以及它们之间的相对丰度、进化关系,进一步探讨微生物多样性;该技术对于研究微生物与人类医疗健康、食品安全、环境检测与治理、微生物资源的利用等有着重要的应用意义。


16S rDNA测序:16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列,采用HiSeq或最新的MiSeq测序仪,对16S rDNA某个高变区进行测序,通过生物信息分析环境微生物中细菌或古细菌的多样性。


18S rDNA测序:18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和高变区,保守区反映生物物种间的亲缘关系,高变区反映物种间的差异。


ITS测序:ITS分为两个区域:ITS1/ITS2,其中ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间,ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。对ITS1或者ITS2进行测序,通过生物信息分析环境微生物中真菌多样性分析。


优势


微生物群落多样性分析优势

应用领域


微生物群落多样性分析应用领域.png

技术路线


微生物群落多样性分析技术路线


产品参数


微生物群落多样性分析产品参数

样本要求


微生物群落多样性分析样本要求

水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究


Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究


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设计思路


设计思路.png


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研究结果

根系3种不同空间位置的间隔区微生物群落存在着自个独特和共有的物种


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


三个间隔区OTUs的富集和贫化差异情况(enriched是与未耕植的土壤对比)


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图2 温室培植实验各个间隔区中OTUs的差异丰度分析(与未耕植土壤对比)

注: rhizosphere (根表面近围) , rhizoplane(根表面),endosphere (根内部)


从图中可以看出不同间隔区之间的OTUs存在着明显的重叠区,也有非重叠区,这就意味着不同间隔区的微生物种类既有差异也有相同。从图2看出微生物物种相对丰度从rhizosphere 、rhizoplane、endosphere先增大后减少,可以推测出在温室培植条件下根系表面近围土壤是根系微生物定植中筛选微生物的第一步,它扮演“门“的角色选择性的排除微生物,控制进入根内部的微生物种类。

土壤不同间隔区微生物群落的定植量随土壤类型不同而改变


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图3 3个种植地点(Arbuckle、Davis、Sacramento)温室条件实验土壤和未耕植土壤的OTUs值的富集和贫化情况的MVA图


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图4 3个种植地点温室条件实验土壤和未耕植土壤的OTUs值的富集和贫化情况的veen图


可以看出随着土壤类型的不同,OTUs的富集和贫化影响也不同,这些结果表明每个土壤中都包含不同的微生物,作物根系并不是局限性于某一特定的物种,而是从土壤中的微生物库中选择性的组成自身独特的微生物群落。

水稻基因型对间隔区微生物群落的影响


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图5 水稻基因型显著地影响间隔区微生物的变化,(A)水稻基因的CAP分析(B)3种土壤类型的根系表面近围的样本内多样性分析结果

注:Glab B、Glab E为非洲的2个不同水稻品种;M104、IR50、93-1、Nipponbare 为亚洲水稻不同的4品种


稻米的基因型对于根系微生物群落的影响非常显著,其中对于根系表面近围的影响最为显著(P=0.005),共发现123个OTUs受到水稻基因型的影响,根系表面近围拥有最多的OTUs,进一步说明它受基因型的影响最大。


地理环境(种植地点)对于野外生长水稻的影响



水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图6 野外种植条件、不同种植地点和培植操作下对根系微生物分离情况(A)种植地点(B)不同收获样本PCoA分析(C)根系表面近围的PCoA分析(D)PCoA分析中培植操作的第二和第三象限


野外种植水稻作物的微生物多样性收到地理环境的显著影响,α多样性分析表明根系表面近围的微生物多样性受到培植地点的影响最大,结果表明地理因素可能对微生物群落根系微生物的形成有影响。


OTUs 中有关甲烷循环(methane cycling 协作的网络

由于水稻根系是在厌氧条件下生长,而且根系周围土壤的微生物活性很高,会产生大量的甲烷。通过构建通过甲烷循环网络,可得到反映出参与甲烷循环的微生物的分布情况。得到的模块中包含产甲烷古细菌Methanobacterium、Methanosarcina、Methanocella、Methanosaeta等。该研究工鉴别出15个模块包含产甲烷菌,组内OTUs的相关性大于0.6或更高。


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图7 OUT协作网络显示出与甲烷循环有关的OUTs模块


根系微生物“获得”的多步模型


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图8 微生物细胞器(质粒和线粒体)16S序列的reads数随时间的比率


水稻根系微生物的结构、变化、迁移研究研究结果


图9 各个间隔区选定的门层级物种(32个)随时间的平均丰度


作者设计了连续取样实验,0、1、2、5、8、13天取一次样品,并用未耕植的土壤做比。结合之前的实验,可以推断出水稻根系组装微生物的第一步是根系表面近围招募根系周围的微生物,第二步是受到包括物种特异性基因类型因素影响的部分微生物进入根系表面的土壤中,该步涉及与土壤有关的物理作用,第三步是微生物由根系表面进入到根系内部,微生物受到更为特异性选择作用,仅仅有部分微生物经过根系表面的选择而进入根系内部。

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研究结论


来自加州大学植物生物学院的Joseph Edwards等人对水稻的根系3个有明显区别的空间结构——根系内、根系表面、根系表面外围的微生物群落进行高通量测序分析,采用的测序仪器为Illumina公司的MiSeq平台,测序策略为PE250,对16S序列的V4-V5区进行测序分析,共得到10,554,561条高质量16S序列,产生了250.000个OTUs值。分别对温室和野外生长的水稻根系3个间隔区探究了多种因素如何促进变异的发生。另外从大样本量中发现甲烷循环(methane cycling)中可能的微生物协作关系。通过对微生物组成的动态研究解析了根系微生物组装(根系获得微生物)的过程。


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参考文献


Edwards J, Johnson C, Santos-Medellín C, et al. Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112(8): E911-E920.


Q微生物多样性分析的产品类型有哪些?


A主要包括:16S  rDNA、18S  rDNA和ITS基因测序三类产品。


Q菌种鉴定可以鉴定到种吗?


A

利用核糖体rDNA的保守区域进行物种的鉴定,只是菌种注释中分子生物学指标的其中一个,一般是通过测序后与数据库进行序列相似度比较,得到物种注释的结果。至于鉴定至种,需要结合如DNA杂交、生理生化指标等来综合判断。目前由于数据库中的存在大量未确定物种归属的16S序列,而且二代测序的测序片段是16S序列的几个高可变区(如V3+V4),因此不能保证每条tags都能鉴定到种。



Q基于高通量测序的环境微生物多样性检测技术上有何优势?


A

常规的研究方法包括基因克隆文库、变性梯度凝胶电泳DGGE/TGGE等,但这些方法的缺点是信息量太小,不能充分反映复杂的环境微生物多样性和分布。

基因克隆文库构建和检测的工作量大,且自然界中99%的微生物在实验室都没有办法纯化培养,从培养基上挑取克隆菌株,摇菌转化测序,效率低下。DGGE法曾经广泛应用于检测微生物群落结构的多态性,但是需要标准菌株,且受到凝胶电泳特性的局限,无法检测到稀有菌群的种类,因此其重复性和分辨率都不甚理想。 第二代高通量测序无需构建质粒克隆文库,这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差,可以直接对环境样品中的基因组片段进行测序,简化了基本操作,提高了测序效率,它能够对一个群落中微生物的多样性作更加深入和全面的描述,且具有通量高,重复性好,精确度高的优点,因而在微生物生态学研究中成为主流手段。




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