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Hi-C技术源于染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture—3C)技术,以整个细胞核为研究对象,利用高通量测序技术,结合生物信息学方法,研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系;通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获,获得高分辨率的染色质三维结构信息,并与ChIP-seq、转录组数据联合分析,从基因调控网络和表观遗传网络来阐述生物体性状形成的相关机制。


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小鼠失活X染色体结构特征


Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse


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设计思路

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研究结果

失活X染色体的结构特征

为了研究失活X染色体的结构,选取来源于高度多态性F1代小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞做等位基因特异的Hi-C分析。首先,在胚胎干细胞中做Hi-C分析,ES细胞中还没有发生X染色体沉默;发现活跃的X染色体含有明显的活跃、 失活区室化(compartment A/B),也没有拓扑结构域结构(TAD)(图1 )。

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图1 胚胎干细胞染色质三维结构特征

高度多态性F1代小鼠胚胎干细胞的神经前体细胞中(NPCs),在常染色质和未失活的X染色体中具有类似的A/B compartment和TAD结构;但是在失活的X染色体中没有A/B compartment(图1),而是由含有DXZ4微卫星的200kb铰链区域分割成两个大的相互作用区域;此外,在失活的X染色体中也没有拓扑结构域(TADs)(图2)。

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图2 失活的X染色体结构特征


含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用

为了研究沉默X染色体中不寻常的两个结构域的重要作用,我们删除了小鼠胚胎干细胞中来源于129亲本等位基因中含有DXZ4位点的200kb边界区域。胚胎干细胞经分化后,分离出许多含有129 亲本X染色体沉默的NPC克隆(ΔFT/D9B2克隆),Hi-C分析表明失活X染色体结构重塑导致了两个大的结构域发生融合(图4 a)。ATAC-seq和RNA-seq表明,在以上分化后的NPC克隆中,87个兼性逃离沉默的基因中有66个失去了转录和染色质亲和特性(图4b)。比较D9B2和野生型NPCS 中沉默的X染色体发现,二者在沉默基因的避免、染色质亲和性缺失和TAD信号减弱有很高的相关性(图4c)。在删除含有DXZ4边界的失活X染色体中,特殊的远距离互作发生了缺失(图4d)。在野生型克隆中用ATAC-seq在沉默的X染色体中检测到的224个peak中,139个在D9B2中是缺失的(图4e);这些缺失位点富集在启动子附近含有CTCF结合位点的区域(图4f,g),这些CTCF更接近于“逃离沉默”的基因转录起始位点(TSSs),再次证明了启动子附近的CTCF在“逃离沉默”的基因调控中发挥着重要作用(图4h)。


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含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用.png

图4 含有DXZ4的边界、CTCF在失活X染色体的三维结构中的作用


Xist在失活X染色体特殊的三维结构重塑中的作用


在未分化的雄性小鼠ES细胞中诱导Xist表达,Hi-C分析发现诱导Xist 48小时导致X染色体结构发生明显变化(图 5a-b);但是在不含A重复区域的Xist突变样品中,基因不发生沉默,染色体三维结构没有变化。野生型Xist诱导不会导致TAD结构的显著改变,但是会导致染色体相互作用频率的增加(图5d), Mb级别的结构域分割边界用RNA/DNA FISH验证是正确的(图5c)。


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图5 Xist在失活X染色体特殊的三维结构重塑中的作用


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研究结论


本研究揭示了失活X染色体的三维结构特征,为研究染色体结构和基因表达的关系提供了强有力的方法,将帮助科学家们更多地了解活细胞中基因组的运作情况;同时有助于开发新的方法,对抗女性X染色体相关的疾病,促进相关疾病的研究与治疗。


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参考文献


Giorgetti L, Lajoie B R, Carter A C, et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse[J]. Nature, 2016. 

Q Hi-C 需不需要做重复?


A理论上是需要做 3 个重复的,但是从成本角度考虑,暂时 Hi-C 可以做两个技术重复,即如果一个样本理论上需要测 180G 数据量,那我们建两个文库,每个文库测 90G,分析数据相关性比较高后将两个文库的数据进行整合。


Q样品交联后检测出现降解、DNA 蛋白复合物少怎么办?


A

1) 植物或者动物组织尽量剪碎,保证充分交联。

2) 要注意交联反应温度(25 度左右)和时间,甲醛处理时间过长,未及时中和容易导致样本降解。

3) 同时要保证样本新鲜。



Qbin size 的真正含义是什么?


A在所设定的 bin size 下,80%—90%以上的 bin 对有 reads 支持(80%—90%bin 与 bin 之间有互作),则认为此分辨率是可以达到的。市场上偷换概念者大有人在,把 bin size 设得特别小,但是很多 bin 都是空的,即和其他 bin 没有互作,可能也就 50% 甚至更低的 bin 之间有互作,达不到承诺的分辨率。


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