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技术简介


单细胞全基因组测序是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是利用MDA或MALBAC技术对分离的单细胞中微量全基因组DNA进行高效扩增,获得高覆盖度的完整基因组后进行高通量测序,生物信息学分析获得细胞中的遗传变异信息,可用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。


优势


单细胞全基因组测序优势


应用领域


单细胞全基因组测序应用领域


技术路线


单细胞全基因组测序技术路线


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      样品要求

1)      细胞分离:由合作方完成单细胞分离;

2)      由公司寄出样品保存液(MALBAC——裂解液;MDA——PBS缓冲液);

3)      样品需求量:1-1000个新鲜细胞,样本体积尽量不超过1-2μl


      其他要求

1)      直接使用公司提供的0.2mL平盖PCR管作为采集管,管盖标注编号;细胞样本需采用不含Ca2+Mg2+的缓冲液洗涤;裂解液避免反复冻融。注意避免起泡;

2)      操作过程中请尽量将采样管置于低温环境下(如冰上) 样本采集管需要用Parafilm封口膜缠绕封口,装入PCR管盒,橡皮筋固定,再装入自封袋,-80℃暂存,大体积干冰运输;防止液体状态下管身颠倒使细胞附于采样管内壁上部; 

3)      送样量:单细胞基因组扩增,建议重复单细胞样本个数不小于3个; 

4)      细胞采样后,请置于96孔管盒中,避免采样管倾倒,尽快寄送,若需保存请置于-80


单细胞基因组测序技术揭示乳腺癌细胞克隆进化机制


Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing

 

单细胞基因组测序技术揭示乳腺癌细胞克隆进化机制.png

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研究背景


肿瘤细胞之间存在高度的遗传异质性,研究发现乳腺癌分为5种与雌激素、孕激素以及人类表皮生长因子受体相关的分子亚型。其中三阴乳腺癌(ER-/PR-/Her2-)表现出大量的突变,而luminal A (ER+/PR+/Her2-)表现出较低的突变频率。相关研究表明三阴乳腺癌(TNBCs)可能导致克隆多样性和突变进化,但是这种推断很难通过群体细胞进行相关验证。

本文开发一种单细胞测序分析三阴乳腺癌肿瘤样本,揭示了来自两个患者(ERBC和TNBC)乳腺癌的种群结构,并结合目标区域测序的大样本验证来揭示肿瘤进化过程中的罕见突变,这对于癌症预后、阶段确定及诊断具有重要的临床意义。


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设计思路

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研究结果

克隆进化分析发现乳腺癌不同的亚型

本文采用染色体断点分析(chromosomal breakpoint analysis)的方法,来分析不同肿瘤细胞亚群之间的联系。研究发现许多肿瘤细胞(大约30%)都混合包含有DNA缺失和增加的情况,就总体DNA数目而言,看上去和正常细胞一样;分析两种类型的乳腺癌组织样本克隆进化种群结构,发现ER样本中存在一个亚群,而TNBC样本乳腺癌中三个亚群,并且这三个亚群是连续的克隆进化关系,每个亚群都由高度相似的拷贝数目的细胞组成。


图1 两种三阴乳腺癌克隆进化分析


图1 两种三阴乳腺癌克隆进化分析


遗传变异分析——发现癌症组织内细胞的异质性

针对ER和TNBC两种类型的乳腺癌样本进行遗传变异位点分析,发现:突变在进化的过程中不断产生,引起大量的克隆异质性;而拷贝数变异往往发生在进化的早期,呈爆发式的出现,从而形成稳定的亚克隆种群,从而解释了癌症组织内细胞异质性产生的原因。


图2 两种三阴乳腺癌遗传变异检测分布


图2 两种三阴乳腺癌遗传变异检测分布


图3 三阴乳腺癌样本遗传变异分析发现癌症组织内细胞的异质性


图3 三阴乳腺癌样本遗传变异分析发现癌症组织内细胞的异质性        

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研究结论


本研究利用单细胞基因组测序和目标区域测序揭示了三阴乳腺癌中三种不同类型的肿瘤细胞亚群都是存在的,每个亚群都由高度相似的拷贝数目的细胞组成。三阴性的肿瘤细胞具有增加的突变率(13.33)。这些研究结果对于癌症预后及阶段确定具有重要临床意义。


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参考文献


[1] Zong, C., et al. Genome-wide detection of single nucleotide and copy number variations of a single human cell[J]. Science , 2012, 338(6114): 1622-1626.

[2]  YongWang, et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing [J]. Nature. 2014, 512(7513): 155-60. 

Q单细胞基因组样本的送样要求


AMDA扩增:取样体积越小越好,最多不可超过2μl,公司提供的管中含2μl PBS。MALBAC扩增:取样体积越小越好,最多不可超过1μl,保证无Ca2+、Mg2+(可以在取样的最后一步用无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤),公司提供的管中含4μl裂解液。单细胞基因组样品尽量使细胞之间是独立分离的状态,避免细胞之间有粘连和细胞碎片,影响扩增质量。


Q单细胞基因组coverage评估


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单细胞全基因组scWGS样品建库后,都需要先试测少量的数据(例:物种-人,数据2G),根据试测的数据用软件进行30X覆盖度的coverage评估,根据评估结果由客户决定是否进行本样品的加测或者重新送样建库。



Q单细胞基因组扩增方法的原理和优劣


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1)MDA(Multiple Displacement Amplification

2001年由Laskin团队发明,使用随机的六聚体引物和φ29 DNA聚合酶进行反应,该聚合酶具有很强的链置换特性,能够在等温的条件下,扩增产生50~100kb的DNA片段。同时由于其3’-5’核酸外切酶活性和校对活性,φ29 DNA聚合酶具有很高的复制保真性。MDA法拥有更高的基因组覆盖度。


2MALBAC(Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles)

拟线性的扩增过程降低了指数扩增的序列偏好性。扩增引物的5’含有27bp的共同序列,3’是8bp的随机序列,可以和模板在15~20℃的低温下结合,经过8~12个循环的拟线性扩增后,再对这些环状的扩增子进行指数扩增。

MALBAC法的优势在于序列偏好性在不同的细胞之间是可重复的,由于其扩增的均一性更好,其数据更适用于CNV分析。MALBAC的弱点在于,它使用的聚合酶保真性不如φ29,因此MALBAC在检测SNV时将会出现更多的假阳性;另外,由于它可重复性的序列偏好性,基因组上低扩增的区域有时会在扩增过程中丢失。





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