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技术简介


10x Genomics是基于微流控技术的单细胞文库制备系统,可以同时获得1,000-80,000以上的单细胞,制备文库和Illumina平台兼容,通过测序实现对高通量单细胞数据进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析。10x Genomics单细胞表达分析可应用的细胞类型众多,如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、神经细胞、生殖细胞、胚胎细胞等,是研究肿瘤异质性,免疫细胞群体和胚胎发育的优秀方法。


10xGenomics单细胞转录组测序应用领域



技术流程

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样本要求


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案例解析



人远端肺类器官模型构建及SARS-CoV-2感染研究


Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids


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研究背景


远端肺部包含促进气体交换的末端细支气管和肺泡,具有重要的呼吸功能。目前在活体中远端肺上皮的人类干细胞种类是从小鼠模型推断出来的。因此,三维体外人远端肺培养系统将极大地促进病理研究,包括间质性肺疾病,癌症和SARS-CoV-2相关的COVID-19肺炎等。来自美国斯坦福大学医学院等研究机构的研究人员以成人肺泡上皮细胞II型(AT2)或KRT5+基底细胞为来源,培育出长期不含饲养细胞的化学限定性远端肺祖细胞培养物:远端肺类器官(organoid)。并以此模型进行了SARS-CoV-2感染研究。


设计思路

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研究结果


1、克隆性肺泡和基底的类器官


远端肺组织体外培养,筛选远端肺祖细胞类型及培养条件(图1a)。

免疫荧光成像(IF)观察到细胞增殖分化为SFTPC+ HTII-280+ AT2囊性类器官(图1b-e)或表达基础KRT5的KRT5+固体类器官(图1b,f-h);

10X Genomics RNA测序证实了SFTPC+ AT2,KRT5+基底细胞和SCGB1A1+棒状细胞群(图1j–j)。10x SPADE和Monocle拟时间分析揭示:共表达KRT5和SCGB1A1的细胞桥接了基础和棒状细胞种群(图1j-k),基底细胞和棒状细胞有分化关系;AT2 与基底细胞和棒状细胞没有谱系关系。


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1-1 人类远端肺克隆增殖



2、人类AT2细胞类器官特征

通过溶酶体染料从混合培养物中获得纯AT2细胞类器官。 EPCAM+ LysoTracker+ AT2细胞克隆扩增至180天(图1l-m)。透射电子显微镜揭示了成熟AT2细胞的微绒毛和层状体(图1n)(类器官可代表器官的一些特征)。当在玻璃上与血清一起培养时,AT2类器官会上调AT1标记(图1o-p)(AT2可分化为AT1)。

混合的远端肺类器官或纯化的肺泡类器官的10X Genomics RNA测序揭示了肺泡群体中AT2细胞marker基因的高水平表达(图1i-k,图1q)。未观察到AT2细胞亚群,并且细胞周期mRNA(cdk1,细胞周期蛋白依赖性激酶,pcna增殖细胞核抗原)并不局限于特定的AT2亚群(图1q)。


人类AT2细胞类器官特征.jpg

图1-2 人类AT2细胞类器官特征


3、人类Basal细胞类器官分化及亚型

形态学观察:在混合的远端肺培养物中,Basal细胞类器官的生长比肺泡类器官的生长更快,并且最初形成了固体KRT5+球状体(图1a-b,f-h)。到1个月时,约有50%的类器官形成了单腔或偶发多腔(图2a-b),并出现了沿内表面排列的棒状(SCGB1A1+ KRT5-)和纤毛(AcTUB+ KRT5-)细胞(图2a-c)。当类器官由3D(图2c,d)转移到2D气液界面(ALI)培养物中时,也发生了类似的分化(图2e)。

10X Genomics RNA测序分析:KRT5+ Basal细胞的scRNA-seq聚类可重复地鉴定出两个种群:Basal1和Basal 2(图2f-g);Basal1有两个亚群Basal1.1,Basal1.2。Basal1包括活跃的循环亚群(Basal 1.2),富含增殖(PCNA,CDK1)和GSEA细胞周期marker基因(图2f-g)。Basal1表达但Basal 2不表达的基因,例如TP6317,ITGA6,ITGB4(图2h)。Basal 2富含水泡运输,内质网过程和鳞状标志物(图2g)。

图2-1 基底类器官分化.jpg

2-1 基底类器官分化

4、TNFRSF12A+祖细胞表征

TNFRSF12A功能研究:锁定Basal 1差异表达的基因TNFRSF12A(图2g–h)。基因拟时间分析显示TNFRSF12A mRNA与增殖标记MKI67密切相关(图2i)。当共表达EPCAM,ITGA6和ITGB4的Basal 1细胞分为TNFRSF12A低,中和高mRNA表达时,增殖基因模块在最高(TNFRSF12Ahi)与最低四分位数(TNFRSF12Alo)明显富集。为了确定这种相关性是否反映了内在的增殖潜能,研究者通过FACS将总的远端肺类器官分成了EPCAM+ITGA6+ITGB4+Basal 1细胞,然后是TNFRSF12AhiTNFRS-F12Aneg亚群(图2j),经培养显示前者具有更大的增殖形成类器官的能力(图2k-l)。

Basal 1与Basal 2关系研究:通过FACS分为EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12AhiBasal 1)和EPCAM+ ITGA6-ITGB4-TNFRSF12AnegBasal 2)。富含Basal 2的基因SPRR1B和TMSB4X(图2g)在Basal 1细胞类器官中被瞬时诱导,表明Basal 2有可能由Basal 1分化。

NOTCH抑制显著增加了来自TNFRSF12AhiEPCAM+ITGA6+ITGB4+细胞的基底类器官增殖,表明NOTCH抑制了生长。相反,NOTCH激动作用不影响增殖,但会诱导SCGB1A1(棒状细胞标志物)。

图2-2 TNFRSF12A+祖细胞表征.jpg图2-2 TNFRSF12A+祖细胞表征


5、肺中TNFRSF12A+细胞的特征

人类远端肺的免疫染色显示,TNFRSF12A+基底细胞在细支气管沟的尖端或基部间歇性富集(图3a)。体内的KRT5+基底细胞的TNFRSF12A+子集显示出比总KRT5+细胞更高的有丝分裂指数(图3b-c),与类器官scRNA-seq一致(图2i)。人远端肺的FACS分析证实了TNFRSF12A在10.9%的基底细胞中表达。FACS分离的EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12Ahi细胞(即TNFRSF12Ahi Basal 1)是EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12Aneg细胞(即TNFRSF12neg Basal 1)的15倍(图3d-e)。 TNFRSF12Ahi基底类器官在长时间培养(图3f)或转换为2D ALI(图3g)时也分化为SCGB1A1+ 棒状和AcTUB+纤毛细胞。

整体而言,类器官模型可以表征人肺的部分特征,可以用于病理研究。

图3 人远端肺TNFRSF12Ahi基底细胞的特征.jpg

人远端肺TNFRSF12Ahi基底细胞的特征

6、类器官模型研究SARS-CoV-2感染机制

严重的远端肺SARS-CoV-2感染会引起肺泡损害和呼吸衰竭,SARS-CoV-2的受体ACE2在棒状细胞和AT2细胞中表达,ACE2在基底类器官中结果一致(图2a)。构建出的远端肺类器官具有顶端朝外的极性,这将ACE2展示在暴露的外表面上(图4a,b),从而促进SARS-CoV-2感染AT2细胞和基底细胞培养物(图4c,d),并鉴定出棒状细胞是一个新的可被这种病毒感染的目标群体(图4g-h)。

图4 远端肺类器官的SARS-CoV-2感染研究.jpg

远端肺类器官的SARS-CoV-2感染研究


研究结论


研究者利用各类荧光标记成像,流式细胞分选,10x Genomics技术筛选到一些组合marker,成功从人类远端肺类器官培养物中筛选到了祖细胞并进行了类器官疾病建模。这种类器官系统应有助于对肺部病原体进行各种调查,类器官SARS-CoV-2感染发现SCGB1A1 +棒状细胞为新型靶标,其感染可能损害保护性肺糖胺聚糖并加速恶性感染周期。


参考文献

Salahudeen AA, et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 2020 Dec;588(7839):670-675. doi: 10.1038/s41586-020-3014-1.


FAQ


Q10x Genomics单细胞转录组测序分析原理


  A

10x Genomics平台能够在7分钟内完成多至80,000个细胞的自动分选,每个油滴包裹凝胶珠(GEM)中含有单个细胞和逆转录反应体系。基因表达定量与细胞群体分类主要利用cell BarcodeUMI信息对单细胞中基因表达量进行分析,并根据表达量对单细胞群体进行划分,寻找群体间差异表达基因。