HiFi测序揭示综合征性智力障碍的致病性结构变异（12-kb 拷贝中性倒位）

Pathogenic 12-kb copy-neutral inversion in syndromic intellectual disability identified by high-fidelity long-read sequencing

智力障碍（Intellectual Disability，ID）是一种常见的发育障碍，其临床特征表现为认知水平低下和适应性能力缺陷。遗传和基因组变异是引起ID的主要原因，如细胞遗传学异常（插入、缺失、倒位和易位）、CNV（删除和重复）和SNP等。一对12岁的单卵双胞胎女孩（II-2和II-3）自5个月时起出现发育迟缓，眼睑严重下垂和癫痫发作，临床症状符合智力发育障碍（图1）。该病例曾进行全外显子测序分析，但未发现致病变异。

图1 患ID双胞胎的临床特征

样本选择：Trio家系（双胞胎女孩之一及其父母，II-2，I-1和I-2）

测序策略：三代 PacBio Sequel II 测序，构建15kb HiFi文库

1. 变异检测及关联位点筛选

先证者 (II-2) 及其父母 (I-1和I-2)测序深度分别为 20.4X，10.8X 和 10.1X，使用pbsv软件对Trio家系进行SV分析。在II-2中共检测到10,616个缺失、15,363个插入、63个倒位和1,476个重复。基于基因对功能的影响程度进行SV筛选，共发现11个缺失、2个插入、2个倒位和1个重复与RefSeq注释的外显子区域有重叠。其中，研究者在3号染色体上发现一个12 kb的倒位变异，IGV分析显示该倒位涉及BRPF1基因的前两个外显子和CPNE9基因的后四个外显子，这两个基因都被倒位变异破坏，可能导致基因功能丧失。而BRPF1基因异常会导致IDDDFP（OMIM＃617333），其特征是智力残疾、面部特征畸形、颈椎融合和癫痫发作。

2. 验证分析

Southern印迹分析显示仅在受影响的双胞胎（II-2和II-3）中检测到与倒位等位基因相对应的5.1 kb KpnI片段，而在其哥哥（II-1）和父母（I-1和I-2）中未检测到。根据pbsv软件的位置信息，研究者利用PCR确定倒位片段（chr3:9,767,386–9,779,615）在连接处没有核苷酸缺失/插入，且双胞胎女孩的倒位断点相同（图2b，c）。Sanger测序鉴定的两个断点连接点和pbsv检测相同，证明了HiFi长读长分析的准确性。

图2 12Kb的倒位变异及其验证结果

3. 单倍体分型追溯倒位变异的来源

研究者通过WhatsHap等软件对目标变异区域进行单体型定相。先证者（II-2）的HiFi数据被分成22,363个单倍型块，平均块大小为84kb。12kb的倒位位于II-2中的321kb的单倍型块内。比较来自Trio家系（II-2，I-1和I-2）的分型结果，揭示了倒位染色体的来源。含染色体位置9,757,086 _ 9,757,754 _ 9,757,993 _ 9,775,730 _ 9,782,977的5个SNP的单倍型G_A_C_A_A证实了12kb倒位遗传自母亲。

图3 单倍型分析揭示倒位的来源

本研究选用三代PacBio HiFi测序对患ID Trio家系进行SV检测分析，挖掘到到一个影响该疾病的12 kb倒位变异。此外，基于Trio家系的单倍型定相分析发现该倒位变异遗传自母亲。研究表明，PacBio测序技术可以发现之前短读长测序遗漏的致病变异。 

[1] Mizuguchi T, Okamoto N, Yanagihara K, et al. Pathogenic 12-kb copy-neutral inversion in syndromic intellectual disability identified by high-fidelity long-read sequencing[J]. Genomics. 2021, 113(1):1044-1053.