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iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantification)与TMT ( tandem mass tag ),均为同位素体外标记定量技术,采用8种或10种同位素标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,对样品中的蛋白质进行标记, 基于串联质谱(LC-MS/MS)检测分析,可同时对多组研究样本进行蛋白质的鉴定和定量工作。是目前定量蛋白质组分析方法中通量最高,系统误差最小,功能最强大的方法之一。

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ITRAQ探究患黄萎病拟南芥中由自噬调节的免疫反应


iTRAQ-based proteomics analysis of autophagy-mediated immune responses against the vascular fungal pathogen Verticillium dahliae in Arabidopsis


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文章摘要

实验通过比较蛋白质组的变化研究植物自噬对轮枝菌感染的防御反应。自噬活动与疾病发展的评估表明自噬活动与拟南芥对黄萎病的耐受性紧密相关。通过iTRAQ 对比感染后的野生型(WT)和自噬缺陷型(atg10-1)植株,共识别出 780 个差异蛋白,其中 ATG8 家族蛋白 193 个。抵抗轮枝菌感染的自噬防御反应的三个重点要素被揭示:自噬活动需要上游防御反应的激活;过程中会发生线粒体自噬,并且这一反应在防御过程中有重要作用;自噬会促进周维管细胞的分化转移和木质部增生,对抵抗维管病有至关重要的作用。这项研究为自噬和植物免疫反应的功能联系提供了新发现。


样本选择
感染轮枝菌的野生型(WT)和自噬缺陷型(atg10-1 )拟南芥的根系组织。


设计思路


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研究结果

1. 实验中共检测到5961个蛋白,其中三个样本共有的蛋白有4940个。经过筛选,共得到 780 个显著差异蛋白。 Atg10-1 突变会导致轮枝菌感应蛋白质组的剧烈变化,大量蛋白累积。 轮枝菌感染后,拟南芥的蛋白质组会随时间变化,实验对感染后三个时间点(24/48/72h)的差异蛋白进行了检测和统计。数据表明在自噬缺陷型植株中,轮枝菌感应蛋白质组的变化发生了延迟,在接受感染后的第 72 小时发生了较为强烈的变化。转折点发生在感染后第 48 小时,即自噬体产生的高峰时段。

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2. 差异表达蛋白 GO 功能注释对差异蛋白的注释分析中,涉及到的与自噬相关的主要生物过程包括防御反应、氧化应激反应、类苯基丙烷代谢、 木质素代谢和线粒体中的亚细胞定位。 这些蛋白按功能可划分为 9 类,其中包括糖类和能量代谢、 蛋白代谢、 信号传递、 应激反应、 转录调控和氧化还原平衡。自噬缺陷型植株中的这些蛋白丰度的变化表明在感染前拟南芥根部组织已经受到了自噬缺陷的影响。


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GO富集有向无环图


3.自噬与由轮枝菌感染引起的防御反应激活密切相关研究中识别出了大量与防御反应有关的蛋白,聚类热图显示这些蛋白主要涉及防御信号通路,氧化还原平衡、木质素合成和致病蛋白。 在轮枝菌感染时,缺陷型植株中的这些蛋白表现出应答缺陷。 结果表明防御反应的激活与自噬过程密切相关。另外,数据还表明自噬反应参与了植物免疫激活,在抵抗随后发生的感染中也起到了至关重要的作用。在抵抗轮枝菌感染的过程中会发生线粒体自噬,自噬缺陷会严重影响线粒体的正常功能。


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4.自噬会促进周维管细胞的分化转移和木质部增生,对抵抗维管病有至关重要的作用。GO 注释与 KEGG 分析显示自噬与类苯基丙烷的代谢和木质素生物合成相关。


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KEGG通路图


Q

什么情况下选择定量蛋白质组学?



A

定量蛋白质组学主要是用于筛查和寻找任何因素引起的样本间的差异表达蛋白,进而对生物学功能或机理改变进行阐释。

如果研究关注的是处理组vs对照组、健康组vs患病组、突变组vs对照组,或者不同发育时期或疾病发展阶段的蛋白质改变,可以选择定量蛋白质组学进行研究



Q

取样时应该注意什么?



A

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义,因此应该根据实验目的谨慎地选择取样方案。病变组织样本中应不夹带正常组织,正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时,应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致,否则可能会影响实验结果的可信度。




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