2022年3月，中国科学院动物学研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室焦建伟老师、王雁玲老师及北京大学杜鹏老师、靳蕾老师在知名期刊Cell Stem Cell（IF: 24.633）在线发表了题为“Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain”的研究文章，通过对人类胚胎各脑区的小胶质细胞的单细胞转录组分析，全面地揭秘了发育阶段人脑小胶质细胞的区域特异性和状态转换的时空动力学，并在和小鼠联合分析中，比较了两物种间状态转换的保守性和分子差异。安诺优达为本次研究提供了10X单细胞转录组测序服务。

研究背景

在脑部发育和神经炎症领域，作为中枢神经系统（CNS）的天然免疫细胞——小胶质细胞发挥着重要的作用，然而卵黄囊组织中相同红髓系祖细胞的小胶质细胞在四个脑区（大脑皮层、间脑、中脑和小脑）的发育路径、状态转换、相关功能特征等领域的研究尚不清楚。

在小鼠的scRNA-seq研究中，小胶质细胞高度异质性和发育相关复杂性的特点已得到证实。此次研究者以人类胚胎不同脑区的小胶质细胞为研究对象，首次发现小胶质细胞在早期胚胎发育中的状态转变，并评估了不同物种之间状态转换的保守性和分子差异。

实验材料

人类胚胎Carnegie Stage (CS) 12卵黄囊和头部组织；

不同孕期的不同脑区包括大脑、间脑、中脑、小脑。

测序策略

10x Genomics单细胞转录组测序

研究思路

研究结果

小胶质细胞单细胞转录组图谱的构建

研究者使用10X单细胞转录组测序技术构建了人类胚胎脑部小胶质细胞的单细胞转录组图谱，根据分选出的CD45⁺CD33⁺ 细胞，对卵黄囊、头部组织、在多个原肠胚形成周的大脑不同解剖位置多位置成分进行分析，识别出20个cluster，成功定义起源、增殖、免疫应答和神经元基因富集四大类小胶质细胞。源于卵黄囊的早期小胶质祖细胞，在人类CS12胚胎的头部表现出细胞增殖、免疫反应和神经系统发育三个明显的分化潜能。

图1 人脑不同发育区域小胶质细胞的scRNA序列和小胶质祖细胞的早期发育

两个小胶质细胞区域规范的发育轨迹——神经元基因富集和免疫

在大脑发育的不同阶段，富含神经元基因的小胶质细胞早在GW8短暂地出现过；免疫小胶质细胞也在后期（GW23左右）表现出其区域特异性。

因此通过Monocle2和URD进行拟时间分析，重现同组CS12原始髓系祖细胞的神经元基因富集和免疫相关小胶质细胞的发育轨迹，结果表明来自CS12卵黄囊和头部（C2/C3）的小胶质祖细胞首先开始增殖，形成不同周期阶段（C6/C9/C10）的小胶质细胞，从而向免疫和神经元基因富集两种分化方向过渡。

图2 小胶质细胞区域特异性的发育轨迹

免疫相关区域特异性小胶质细胞的独特特征

研究者进一步对两类区域特异性小胶质细胞进行探索。富含免疫或神经元基因富集的小胶质细胞携带转录组信息不同，这可能与中枢神经系统早期发育四个脑区的各种功能和动态微环境有关。为更准确分析胎儿中枢神经系统早期发育小胶质细胞的状态转换，使用FACS和10x单细胞转录组测序，从Cor区分离并富集CD45^IntCD11B^pos阳性细胞，最后获得25891个小胶质细胞，从而利用新发现的亚群更全面地构建了大脑皮层小胶质细胞的高分辨率发育图谱。

胎儿小胶质细胞的区域特异性和状态转换之间也表现出了明显的潜在联系。干扰人类小胶质细胞内稳态基因可使人类小胶质细胞从相对静息状态退出，过渡到激活状态。经典稳态基因SLC2A5与CNS疾病相关的基因的高表达共同诱导激活了免疫相关的小胶质细胞簇，从而揭示出胎儿脑部特异性的小胶质细胞的独特特征。

图3 区域特异性小胶质细胞的独特特征

图4 区域特异性的胎儿小胶质细胞静息——激活状态改变

人和小鼠发育中状态转换存在保守性和分子特征差异

选用小鼠卵黄囊（E8.5）、头部组织（E9.5）及大脑Cor组织（E10.5-P20）的Cd45^intCd11b^pos细胞进行单细胞转录组测序，人类小胶质细胞通过激活CX3CR1、TMEM119和P2RY12/13的表达，在GW8开始获得内稳态。诱导典型的小胶质细胞激活基因，可使其在GW23被沉默，这代表人类胚胎活动状态的转变。小鼠中静息相关基因的诱导主要发生在E13.5，直至小鼠出生这些基因才出现减少，小胶质细胞进入活跃期。因此发育的小胶质细胞在静息——激活状态转换是保守的，但分子特征是不同的。

巨噬细胞相关基因方面，LYVE1、MRC1和F13A1在人类早期YS或head中的表达最高，然后逐渐降低。相比之下，小鼠Lyve1、Mrc1和F13a1基因表达在E10.5中高度富集，在早期胚胎发育中下降。人类 CS12-Head在转录组水平上与小鼠E10.5最相似。大多数其他细胞类型可以合并，人类和小鼠的几种细胞类型和发育途径也是保守的。

进一步DEGs的分析表明，人和小鼠小胶质细胞间在物种特异性基因的表达、功能亚类上存在确定性的差异。基因集富集分析（GSEA）显示，人类的细胞粘附分数、细胞因子相互作用、MAPK信号通路和Toll样信号通路更丰富。此外，研究者还鉴定出了PT-MG、AR-MG、CM-MG、MiR-MG和SP-MG集群中的人类和小鼠DEG。

图5 人和小鼠小胶质细胞在发育中状态转换的保守性

图6 人和小鼠小胶质细胞分子特征的差异

总结

作者通过对发育中的人类胚胎各脑区的小胶质细胞的单细胞转录组分析，并结合实验验证，首次定义并描述了区域规范和状态转换相关的小胶质细胞的发育轨迹；在神经元基因富集相关的小胶质细胞中，重新鉴定出了几个具有区域特异性的相关亚类；在免疫相关的小胶质细胞中，它们在中枢神经系统发育的后期表现出区域特异性，同时它们也出现了静息——激活状态的改变；此外，人和小鼠小胶质细胞在发育中状态转换具有保守性，但存在分子差异。

参考文献

Yanxin Li, Zhongqiu Li, Min Yang, etal.Decoding the temporal and regional specification of microglia in the developing human brain[J]. Cell Stem Cell,2022.

针叶树在世界森林生态系统中占主导地位，是种植最广泛的树种之一。针叶树基因组属于大型基因组，存在高度重复序列(70%-80%)，因此基因组组装难度较高。

研究者利用PacBio测序、Hi-C辅助组装等技术，组装获得了25.4 Gb染色体水平的油松基因组。通过使用来自760个生物样本的大规模RNA-seq数据来辅助基因结构注释，揭示油松基因组扩展、生殖过程和适应性进化的多重基因组特征和分子机制，给针叶树进化研究提供了新思路，为今后进一步开展针叶树适应与发育研究提供了数据参考。

35年生无性系优良油松的新芽

DNA测序策略

Illumina NovaSeq 6000，DNA小片段文库，103 X

PacBio Sequel II基因组测序，103 X

Illumina NovaSeq 6000，Hi-C文库

RNA测序策略

Illumina测序，构建RNA文库

油松染色体基因组组装和注释

研究者首先通过Illumina测序，对油松基因组大小进行评估，随后利用PacBio测序数据进行自校正和组装，成功构建出24.4 Gb(96.1%，12条染色体）的油松高质量的染色体水平基因组。

针叶树中的基因通常多于二倍体被子植物，基因复制导致了许多基因家族的扩张。在基因复制的不同类别中，油松的旁系同源主要来源于分散重复(DSD)，很少来自全基因组复制(WGD)，油松发生近期全基因组复制事件概率较低。

图1 油松高质量基因组组装

长内含子的独特基因空间结构

油松的基因组存在大量的长内含子，总内含子/外显子长度与基因组的大小呈正相关，基因表达水平的差异与基因长度和内含子数有关。长基因的RNA剪接和DNA甲基化检测结果表明，几乎所有CG和CHG位点都发生了甲基化，DNA甲基化可能参与了长内含子的准确识别。

图2 油松基因组的基因空间结构和复杂性展示

油松的适应进化

通过功能富集分析发现了3,623个显著扩张的家族基因，主要参与生物和非生物胁迫反应。通过鉴定油松中的转录因子(TF)和转录调节因子(TR)家族，发现对低温高度敏感的AP2/ERF基因家族成员可能在油松的低温适应中发挥关键作用。在候选基因编码酶鉴定中，萜烯合成相关基因在不同树龄的油松中有明显的表达模式，新形成的针叶可能是萜烯的主要合成部位。

图3 油松中萜烯的合成途径

针叶树生殖发育的独特调控网络

被子植物中具有很多调节开花的关键基因，但油松中缺少很多同源基因。FT/TFL1-like基因是被子植物中调节开花的关键基因，但油松中仅有2个拷贝，但在其他针叶树中一般有4-6个拷贝。研究者在拟南芥中做了转基因验证，过表达了这两个基因，转基因植株表现出明显的晚开花表型。

通过对油松基因组中12个高表达的MADS-box基因的酵母双杂交检测，发现两个AGL6-like基因（PtDAL1和PtDAL14）在油松中有不同的表达模式，其中PtDAL14在生殖器官中特异性表达，与其他MADS-box转录因子蛋白相互作用，表明AGL6-like基因可能作为MADS-box转录因子之间相互作用的桥梁，从而形成互作网络。最后研究者提出了一个控制油松雌雄球果发育的模型，为今后针叶树生殖发育研究提供了一张蓝图。

图4 油松中12个MADS-box家族转录因子的表达及蛋白互作模型

油松近期的LTR-RT的爆发和稳定的甲基化维持系统

从染色体层面看，基因组甲基化水平与油松的TE覆盖率显著相关，研究发现携带TE的基因区域的平均甲基化水平远高于不携带TE的基因区域，但TSS和TES区域的平均甲基化水平始终较低。DNA甲基化对于TE基因组的扩张产生了影响，但未有证据表明，油松甲基化程度随树龄的增加而下降。LTR-RTs代表了大部分TEs，不平等重组（UR）是植物中一种重要的LTR-RT清除机制，针叶树的UR率可能比被子植物小型基因组低得多，SGS3-RDR6-RdDM通路可能是针叶树中主要的DNA甲基化途径。

图5 油松中DNA甲基化及转座子扩张

研究者构建了当前大型基因组中连续性最好的高质量染色体水平的油松基因组。研究发现转座子的不断扩张和缓慢清除是导致针叶树基因组巨大的重要原因，具有超长内含子的大基因往往表达水平较高。与被子植物相比，油松具有独特的生殖系统。油松基因组的构建为其独特适应性和发育研究、生殖生物学研究及基因组辅助育种进化和基因组学研究提供了重要参考。

作为国内基因组行业知名企业，安诺优达拥有实力强大的测序服务平台，配备系列先进仪器设备，三代PacBio（2台Sequel IIe+7台Sequel II+10台Sequel）为您的科研之路保驾护航；专业的生物信息分析团队，丰富的项目分析经验，让您的数据分析之途无忧。安诺基因已与中国农业大学、中科院遗传与发育所、中国海洋大学、中国农业科学院、福建农林大学等多家科研院所开展了深度合作，助力基因组文章发表于Cell、Nature、Nature Genetics、Nature Plants等多个国际高水平期刊。

参考文献

[1] Niu S.H., Li J., Bo W.H., Yang W.F., Zuccolo A.,Giacomello S., ChenX., Han F.X., Yang J.H., Song Y.T., Nie Y.M., Zhou B.,Wang P.Y., Zuo Q., Zhang H., Ma J.J., Wang J., Wang L.J., Zhu Q.Y., ZhaoH.H., Liu Z.M., Zhang X.M., Liu T., Pei S.R., Li Z.M., Hu Y., Yang Y.H., LiW.Z., Zan Y.J., Zhou L.H., Lin J.X., Yuan T.Q., Li W., Li Y., Wei H.R. & WuX.The Chinese pine genome and methylome unveil key features of coniferevolution[J]. Cell, 2022, 185(1):1-14.

2021年7月15日，由福建农林大学、中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所等多家单位共同合作在国际顶级期刊Nature Genetics上发表“Haplotype-resolved genome assembly provides insights into evolutionary history of the tea plant Camellia sinensis”的文章，该研究利用自主开发的新算法破译了高杂合铁观音的基因组组装难题，并在此基础上阐释了等位特异性表达应对”遗传负荷”的机制及茶树群体进化和驯化历史，为茶树育种改良提供了新见解。安诺优达为本次研究提供二代和PacBio三代建库测序服务。

1. 基因组组装与注释

铁观音的基因组大小约为3.15 Gb，杂合度为2.31%。利用PacBio长读长对原始数据进行组装得到初始contig，大小为5.41 Gb。将Khaper算法过滤产生的单倍体组装结果挂载到15个染色体（图1），得到单倍体参考基因组（monoploid reference genome），大小为3.03 Gb。同时利用ALLHiC算法得到铁观音单体型基因组（haplotype-resolved genome），大小为5.98 Gb。共线性分析显示它们的基因顺序高度一致。

图1 铁观音基因组组装和质量评估

（a）单倍体参考基因组circos图，呈现15条染色体特征；（b）Hi-C热图呈现15条染色体组装质量；（c）LAI（LTR Assembly Index）评估铁观音基因组和已发表茶树基因组组装质量；（d）铁观音单倍体参考基因组和单体型基因组的共线性比较

2. 等位基因特异性表达

利用铁观音不同组织的全基因组测序，分离得到14,691个等位基因（图2），其中1,528个基因存在一致性的等位特异性表达（consistent allele-specific expression,  ASEGs），即一个等位基因在所有组织和样本中的表达都高于另一等位基因。基因富集分析显示这些基因参与核糖体等多个生物学基本过程，与克服有害突变的潜在机制相关。同时还发现了386个非一致的ASEGs，它们在不同组织的等位基因之间存在特异性表达。其中几个基因与挥发性有机化合物的生物合成有关，包括黄酮和黄酮醇等的生物合成途径，这与植物的适应性演化相关。结果表明，在铁观音基因组中，一致性的ASEG明显多于不一致的ASEG（1,528 vs 386），这一趋势与杂交水稻的结果正好相反，即在杂交水稻中，不一致的ASEG远远大于一致性的ASEG。这种现象或许可以用杂种优势理论中的显性效应解释，长期无性繁殖的茶树利用优势等位基因应答不断积累的遗传负荷，以保持个体的适应度。

图2 茶树单倍型基因组等位不平衡

(a) 两个单倍型序列的比对（10 Mb非重叠的窗口）；（b）等位基因CDS序列比较；（c）等位基因的选择压力分析；（d）等位基因的非同义替换位点数目分布；（e）等位特异性表达基因（ASEGs）在茶树叶片中的表达情况；（f）举例说明一致性的ASEGs（CsSRC2）；（g）举例说明非一致的ASEGs（CsGGPS1）

3. 茶树遗传变异和群体结构分析

通过对161份茶树种质资源重测序数据分析，发现样本主要分为三类（图3），分别为大理茶，大叶茶和小叶茶，与茶树的形态学分类一致。另外大叶茶可以分类古大叶茶和栽培大叶茶；而小叶茶依据地理分布可分为四个亚组，分别为SSJ（陕西，四川，江西），ZJNFJ（浙江和福建北部），SFJ（福建南部），HHA（湖北，湖南和安徽）。TreeMix分析发现这些茶树之间存在显著的基因流动，表明种内基因交流频繁，其中一些与有记录的茶树杂交育种历史相吻合。

图3 茶树群体系统进化与群体结构分析

（a）重测序样本的地理分布；（b）群体系统发育树；（c）PCA主成分分析；（d）群体遗传结构分析（k=7）

4. 大叶茶和小叶茶的进化史和驯化史

对14种山茶属植物的21株单株进行了全基因组测序，通过群体遗传分析发现大叶茶和小叶茶具有不同的进化史。在Gelasian epoch时期（259-181万年前），剧烈的气候变化很可能导致了整个茶树物种（包括大叶茶和小叶茶）的群体收缩；两个变种分化后，仅小叶茶在Last Glacial Maximum时期（2.65-1.9万年前）可能由于温度骤降出现了再一次的群体收缩，但随后适应了环境的小叶茶迅速扩张，群体规模得到恢复。该分析表明，大叶茶和小叶茶分化后的进化史不同（图4）。

通过对大叶茶和小叶茶驯化基因的分析，发现它们的驯化过程是并行的（即独立驯化），这些驯化基因参与了一系列重要的生物学过程且受人工选育的偏好性影响。基于KEGG分析，在大叶茶驯化早期以参与氧化石墨烯苷转运、糖苷转运通路为主，后期品种改良主要集中在合成生物碱和芳香化合物等。例如，研究人员鉴定到CsXDH基因在大叶茶品种改良阶段受到强烈的人工选择，该基因编码黄嘌呤脱氢酶，是咖啡因合成通路的重要基因。而小叶茶品种的早期驯化与植物抵御相关，改良过程主要集中在花发育的调控和对一氧化氮的响应，已有研究表明，NO的积累可以加速γ-氨基丁酸的消耗从而帮助植物抵御冷胁迫，这表明筛选耐寒的品种也是人工选育的重要目标。

2021年7月12日，福建省淡水水产研究所薛凌展团队联合福建师范大学、华中农业大学和维也纳大学等单位，在Genome Biology在线发表题为Telomere-to-telomere assembly of a fish Y chromosome reveals the origin of a young sex chromosome pair的论文，从染色体层面解析了大刺鳅基因组，对性染色体的起源及重组抑制进行了相关研究，构建了鱼类Y染色体完整图谱，提出动物性染色体近着丝粒起源的假说。安诺优达在本研究中提供了三代测序、Hi-C辅助组装以及RNA-Seq等多组学测序技术和服务。

文章小结