安诺优达单细胞全长转录组测序基于10X Genomics和MAS串联技术，通过二代测序+三代测序联用方法，不仅可以获得更加精细的细胞聚类、细胞注释，而且还可以挖掘到在肿瘤、系统性疾病、发育生物学等研究中非要重要的可变剪切、融合基因、RNA水平突变等信息。
应用领域
- 肿瘤的发生发展研究
- 疾病潜在标志性基因的挖掘
- 胚胎、器官发育轨迹的研究
- 胁迫响应机制的探究等
单细胞全长转录组
- 产品简介
- 技术流程
- 样本要求
- 案例分析
- FAQ
| 样品要求 | |
| 细胞分离 | 由合作方或安诺完成单细胞悬浮液的制备 |
| 样品类型 | 活体新鲜完整细胞的细胞悬浮液；冻存的细胞悬浮液；不适于经固定、染色等处理的样本 |
| 样品总量 | 总量>6*105个，同一个细胞平行准备2份（1份质检，1份实验） |
| 样品浓度 | 700-1200个/μl |
| 样品质量 | 细胞不能成团，少碎片，活性>85%，细胞直径<30μm，不存在逆转录抑制剂及非细胞的核酸分子 |
| 细胞冻存液保存 | 分装保存于冻存液中，细胞冻存液：DMEM+20%FBS+10%DMSO |
| 冻存液细胞浓度 | 100万个细胞/ml，每1ml分装至1个冻存管 |
Detection of isoforms and genomic alterations by high throughput full-length single-cell RNA sequencing for personalized oncology
期刊：BioRxiv 发表时间：2022.12
研究背景
癌症是一种复杂疾病，基因组和转录组层面各维度的异常都可能参与到驱动肿瘤的形成和演变过程中，包括点突变、插入缺失、基因融合、基因拷贝数变异、可变剪接导致的不同转录异构体等等。除此之外，肿瘤内部的异质性及其与肿瘤微环境（TME）的相互作用，更是提升了其复杂程度。因此，了解癌症的复杂背景需要单细胞分辨率的基因型-表型信息，通过单细胞短读长和长读长测序方式，获得基因表达定量及全长转录本信息。
研究方案
3个人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者的3个肿瘤转移样本和2个正常样本；
10X Genomics二代测序，20,000-50,000 reads/cell；
cDNA串联成8-11 kb的长片段，三代测序，12,000 reads/cell；
研究结果
该研究选取了3位HGSOC的肿瘤样本和癌旁配对样本，进行了2代短读长和3代长读长测序。结果发现，两者单独鉴定的细胞类型和种类占比非常相似。其中，长读长测序共识别了152,546个异构体，超过52,000个是新发现的转录异构体，42%具有蛋白编码功能。联合bulk DNA数据，从长读长数据中鉴定到了48个生殖系突变和34个体细胞突变。并且，肿瘤细胞中含有8%的特异性isoforms，远高于正常细胞。在肿瘤细胞和间皮细胞中存在 isoform 亚型的差异表达，且转移样本中存在间皮和成纤维细胞之间的转化。以基因 IGF1（胰岛素样生长因子）为例，来自所有患者的癌细胞几乎完全使用该基因的第二个外显子作为转录起始位点（II类亚型），而其他细胞主要使用第一个外显子（I类亚型）。此外，在2号肿瘤样本细胞中检测到IGF2BP2::TESPA1的融合，而在对应的短读长数据中被错误的识别为TESPA1的高表达。总体来说，文章展示了单细胞全长转录组技术在肿瘤研究中的应用潜力。
参考文献
A. Dondi et al., Detection of isoforms and genomic alterations by high-throughput full-length single-cell RNA sequencing for personalized oncology. bioRxiv, 2022.2012.2012.520051 (2022)
- Q：单细胞全长转录组实验流程A：前部分实验与10X Genomics单细胞转录组一致，通过微流控平台将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中。在每个GEM中，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于带Barcode和UMI信息的cDNA。然后将cDNA一分为二，同时进行二代建库测序和MAS串联三代建库测序。