全长转录组测序（Iso-seq）是指利用三代测序技术对生物体内完整的RNA分子（包括5'末端到3'poly A尾的全长序列）进行测序，RNA分子无需打断，测序可直接获得完整序列。通过全长转录组测序能够更准确地得到转录本信息，可鉴定更多可变剪接位点、新基因和新的异构体、融合基因等。
| 产品类型 | 测序策略 | 推荐数据量 |
| 全长转录组 | 构建一个1-10kb的Iso-Seq文库 | 30Gb subreads、50Gb subreads |
| 送样要求 | |
| RNA总量 | ≥2μg |
| RNA浓度 | ≥230 ng/μl |
| RNA纯度 | OD260/280=2.0~2.2 |
| OD260/230=1.8~2.1 | |
| 其它要求 | RIN≥7.2 28s:18s≥1.0 |
| 不能反复冻融 | |
| 不要暴露于高温（＞65℃） | |
| 不要暴露于高低pH（＜6 or ＞9） |
| 样本类型 | 建议送样量（无需生物学重复） | 推荐部位 |
| 植物组织 | ≥3-4g | 幼嫩组织 |
| 动物组织 | ≥1-2g | 内脏、鳃等 |
| 细胞 | ≥1x107个细胞/文库 |
本项研究利用全长转录组测序提高了辣椒基因组的注释水平，为研究其功能基因组学提供了新思路；分析了NAT基因在辣椒生长过程中的广泛作用以及cis-NAT的进化机制。
通过PacBio Iso-Seq测序，研究中共获得了57,962条高质量全长转录本，新发现基因5,769个。全长转录组测序的优势之一是可以获得mRNA的完整UTR区域，对与参考基因组拥有相同CDS区域的全长转录本进行分析，新测得的5'和3'UTR分别最高可达100nt和250nt，远远高于参考基因组的平均50nt（图1），这表示全长转录组测序可以捕获更多完整的基因结构。
此前辣椒的基因注释主要基于短读长测序，对低表达基因外显子的覆盖度不够，导致一些基因模型的构建呈片段化。本次研究中利用PacBio测序修正了近500个注释错误，使片段化的基因模型趋于完整，被修正的模型多数含有较多的外显子或较长的内含子区域（图2）。
研究中通过全长转录组测序共获得2,057个cis-NAT和5,880个基因的34,193个trans-NAT，后者55.1%的互补序列都来源于转座子（图3）。通过分析NAT的表达模式，发现它们参与了辣椒的多种生物过程如辣椒素的合成等（图4）；同时，对茄科植物进行了cis-NAT特点及进化分析，发现转座子可能参与新的cis-NAT形成（图5）。
该研究利用全长转录组测序提高了辣椒基因组的注释水平，在基因组范围内分析了NAT基因的功能和进化过程，为研究辣椒的功能基因组学提供了新思路。
参考文献
Wang J, Deng Y, Zhou Yi, Liu D, Yu H, Zhou Y, Lv J, Ou L, Li X, Ma Y, Dai X, Liu F*, Zou X*,Ouyang B*, Li F*. Full-length mRNA sequencing and gene expression profiling reveal broad involvement of natural antisense transcript gene pairs in pepper development and response to stresses. Plant J, 2019, 99: 763-783.
