三代宏基因组测序是指利用PacBio第三代单分子实时测序技术以特定环境下微生物群体基因组为研究对象，组装出核心菌群的基因组，在分析微生物多样性、种群结构、进化关系的基础上，可进一步探究微生物群体功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系，发掘潜在的生物学意义。与二代测序方法相比，三代宏基因组采用PacBio SMRT测序的长读长可以减少部分组装错误，有效提高微生物群落鉴定的分辨率。
| 产品类型 | 测序策略 | 推荐数据量 | 周期 |
| 三代宏基因组测序 | 10kb HiFi DNA文库 | ≥50G | 50天 |
| 送样要求 | |
| 样本送样量 | 粪便（3-5g），土壤（≥10g） |
| DNA总量 | ≥5μg |
| DNA浓度 | ≥80ng/μg |
| DNA纯度 | OD260/280在1.8-2.0， OD260/230在1.6-2.5， NC/QC在0.5-3.0 |
| 其他要求 | 无RNA污染，DNA样本无颜色，主带集中无降解，不粘稠，无杂带 |
期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 发表时间：2020.03 发表单位：马里兰大学医学院基因组科学研究所 影响因子：4.123
细菌阴道相关细菌1 (BVAB1)是一种在人类阴道中发现的尚未培养的细菌物种，属于梭状芽孢杆菌目Lachnospiraceae。这种细菌通常与细菌性阴道病(BV)有关，BV是一种常见的阴道疾病，已被证明会增加妇女感染艾滋病毒、沙眼衣原体和淋病奈瑟菌的风险以及早产的风险。目前还没有BVAB1的完整基因组序列，使得系统性地理解其在疾病中的作用变得困难。
利用PacBio Sequel II平台进行宏基因组的测序和组装，并与二代数据的组装结果进行比较，突出三代测序宏基因组组装结果的优势。
利用从所有MAG（metagenome-assembled genomes）中提取的全长16S rRNA基因进行系统发育进化树分析，结果表明BVAB1属于梭状芽孢杆菌科（Clostridales）家族的毛螺菌科（Lachnospiraceae）。已知亲缘关系最近的种为Shuttleworthia satelles。
图1 系统发育进化树分析
文章提出建议将BVAB1重新命名为Candidatus Lachnocurva vaginae，其代表了BVAB1的系统发育位置、细胞的弯曲形态和cMAG（circularized metagenome-assembled genome）的来源。cMAG与Shuttleworthia satelles基因组的平均核苷酸同源性（Average Nucleotide Identity, ANI）为81.85%。Ca. Lachnocurva vaginae彼此之间的16S rRNA基因同源性＞99.7%，cMAG和MAG之间的同源性也很高（98.6-99.2%，如下表1）。
表1 Ca. Lachnocurva vaginae基因组间同源性分析
三代测序组装出的cMAG全长1,649,642bp，GC含量为31.8%，编码1,578个基因，完整性为99.1%，污染程度为0。长读数对cMAG组装的平均覆盖率为124倍（范围：26-285）。
使用短读长的Illumina HiSeq4000宏基因组数据组装的MAG大小为1.48-1.62Mb（平均：1.57Mb），contigs的数量从26到152（平均N50：99,943bp），GC含量为31.6%。
基因组注释表明cMAG中存在4个完整的rRNA操纵子拷贝（图2），在基于Illumina的MAG中只发现了部分rRNA的操纵子。
图2 Ca. Lachnocurva vaginae的基因组Circos图展示
表2 Ca. Lachnocurva vaginae的MAG组装特征
在所有的MAG中都发现了编码甘露糖、果糖和L-抗坏血酸转运蛋白的基因，以及一个D-乳酸脱氢酶基因。它们是糖酵解、丙酮酸氧化和戊糖磷酸途径的非氧化阶段的完整途径。甘露糖在所有样品的代谢体中明显缺失或低于检测极限，但存在于其他Ca. Lachnocurva vaginae相对丰度不高的BV-like样品中（图3）。
图3 化学物质的代谢特征
（阴道群落状态类型CST IV-A（Ca. Lachnocurva vaginae相对高丰度）、CST I（以乳酸杆菌为主）和CST IV-B（阴道加德纳菌））
进一步找到了Ca. Lachnocurva vaginae具有吸收和代谢甘露糖的遗传能力（LCV A_1184）（图4），表明了甘露糖也可能是Ca. Lachnocurva vaginae的碳水化合物来源。
图4 Ca. Lachnocurva vaginae的基因组特征
在所有宏基因组中鉴定到鞭毛装配所需的全套基因，以及接受趋化作用的甲基和介导鞭毛反应的下游信号过程所需的基因。但肉眼无法观察到Ca. Lachnocurva vaginae的鞭毛（图5），表明Ca. Lachnocurva vaginae和宿主组织之间的直接相互作用。
图5 样品革兰氏染色照片
本文通过测序组装了Candidatus Lachnocurva vaginae基因组，之前称为Bvab1，是细菌性阴道炎患者阴道微生物群落的重要成员。由于该微生物无法培养，通过16S rRNA基因序列的一小部分区域检测该细菌，对其对阴道微生物群的贡献和对生殖健康的影响了解有限。研究证明，这种微生物在环境中响应营养信号，使用外排系统抵抗抗生素，并与细菌性阴道炎的鱼腥气味特征有关。有必要进一步研究Candidatus Lachnocurva vaginae基因组特征，确定其在阴道微生物群中的作用。
Holm J B , France M T , Ma B , et al. Comparative Metagenome-Assembled Genome Analysis of "Candidatus Lachnocurva vaginae", Formerly Known as Bacterial Vaginosis-Associated Bacterium1 (BVAB1)[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2020, 10.
