近期，安诺优达单细胞测序产品在生命科学和生物医学领域的应用不断拓展，连续发布了两篇合作文章，上期我们介绍了单细胞测序揭示卵巢癌新型耗竭T细胞标志物的相关内容，为卵巢癌患者的治疗提供了新的思路，本期让我们一起来探究小鼠肠隐窝电离辐射损伤修复多重效应的相关研究吧~
2023年10月，中国医学科学院放射医学研究所张俊伶副研究员、樊赛军研究员在Redox Biology（IF=11.4）发表题为“Single-cell RNA sequencing of intestinal crypts reveals vital events in damage repair and the double-edged sword effect of the Wnt3/β-catenin pathway in irradiated mice”的文章。通过对小鼠肠隐窝的单细胞转录组研究，探讨了肠隐窝辐射损伤修复中的重要事件和Wnt3/β-catenin通路的多重效应，提出了肠隐窝干细胞和巨噬细胞之间通过MIF-CD74/CD44通路的相互作用可能加剧高剂量辐射暴露小鼠的小肠损伤的新观点。安诺优达为本研究合作作者，并提供了10× 单细胞建库测序和分析服务。
研究背景
放疗是癌症治疗的重要手段，但是放疗通常伴随着对正常组织的损伤，一定程度上限制了其应用。电离辐射诱导的分化细胞死亡和肠隐窝干细胞丢失是辐射损伤主要原因之一。辐射暴露后，肠上皮细胞的损伤修复呈动态变化，该过程中涉及的关键信号通路仍需进一步阐明。
材料选择
特异性无病原体C57BL/6雄性小鼠肠隐窝样本；
样本共设置五组，每组小鼠3只；
分别为13Gy—辐射暴露后1天组、13Gy—辐射暴露后3天组、13Gy—辐射暴露后5天组、15Gy—辐射暴露后3天组（Gy为放射治疗剂量单位）。
测序策略
10x 单细胞转录组测序&Illumina PE150
研究内容
单细胞转录组揭示13Gy腹部辐射暴露后肠隐窝细胞比例和基因表达的动态变化
辐射暴露后，肠隐窝基底部细胞（crypt base columnar，CBC）的再生对整个肠上皮的修复至关重要。选取13Gy腹部辐射暴露后不同时间点的小鼠肠隐窝进行单细胞转录组测序。研究者发现CBC细胞和瞬时扩增细胞（transient amplification，TA）比例呈显著变化（图1 A-D）。继续聚焦到基因表达，CBC和TA细胞显著富集的差异表达基因具有相似性，这些基因与干细胞标记物、细胞周期、细胞凋亡、细菌防御等相关（图1 J）。值得注意的是，CBC和TA细胞中许多上调基因参与了细菌的防御和抗菌免疫反应，提示细菌感染是辐射损伤后的严重威胁之一，宿主细胞对细菌的防御反应可能是13Gy腹部辐射暴露后DNA损伤修复期间的重要事件。
图1 13Gy腹部辐射暴露后小鼠肠隐窝细胞组成及基因表达动态
辐射暴露后TA细胞簇呈现高度异质性的特点
为进一步探究放疗对CBC和TA细胞分化的影响，研究者进行了不同组中CBC和TA细胞分化轨迹分析：未经辐照的CBC细胞接近潜伏时间的末尾，与之相反，辐射暴露后的TA细胞几乎出现在潜伏时间的所有位置，提示TA细胞可能是辐射损伤修复过程中的关键亚群。RNA速率分析结果同样证实了TA细胞各亚群的分化特点（C3和C7亚群向EC簇转化，C5亚群向goblet簇转化，C8亚群向Clu+revSC簇转化，图2 G-I）。以上结果提示，辐射暴露后肠隐窝TA细胞具备高度异质性，可能分化为成熟细胞或去分化成为干细胞。
图2 辐射照射后肠隐窝细胞分化轨迹分析
Wnt3/β-catenin通路在辐射诱导的肠损伤中具有双重作用
随着辐射剂量的增加肠道损伤加剧，15Gy辐射暴露后的第3天，小鼠肠隐窝的CBC细胞仍然遭受严重的损伤。激活Wnt信号通路可以使辐射诱导的肠道损伤再生，并维持肠道干细胞稳态。Wnt配体（Wnt3a、Wnt4和Wnt5）可能参与了肠隐窝辐射损伤的修复。同时药物测试的动物实验表明，经典的Wnt通路可能参与了15Gy辐射暴露后的肠道辐射损伤过程。
15Gy腹部辐射暴露可能通过肠干/祖细胞与巨噬细胞之间的MIF-CD74/CD44相互作用诱导小鼠死亡
应用单细胞数据进行细胞通讯分析，研究所有簇间受体-配体的相互作用。Wnt配体主要与CBC、TA细胞等受体信号相互作用，Wnt3/β-catenin通路在肠干/祖细胞损伤修复中发挥作用，这种作用是把“双刃剑”，可能影响部分其他细胞，导致更严重的损伤。
图3 细胞通讯分析各亚群间的相互作用
进一步分析提示，15Gy腹部辐射暴露可能诱导巨噬细胞中CD44的上调，并增加MIF与CD44的结合。在辐射暴露后第2天用单克隆抗体阻断CD44可有效减少小鼠死亡。通过清除氧自由基来改善辐射损伤的治疗策略可以抑制巨噬细胞中CD44的表达，促进肠上皮中MIF与CD44的结合，从而修复肠道辐射损伤。
结论
本研究揭示了高剂量腹部辐射暴露诱导小鼠死亡的潜在机制，Wnt3/β-catenin信号通路促进了辐照暴露小鼠肠隐窝干细胞/祖细胞的恢复，诱导巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的释放，进一步修复了电离辐射诱导的肠损伤。随着辐射剂量的增加，巨噬细胞上的CD44被激活，为MIF信号转导提供受体，启动炎症级联反应，最终引起炎症风暴导致小鼠死亡，为探索辐射损伤防护救治提供新思路。
参考文献
Tong Yuan, Junling Zhang, Yue Zhao, Yuying Guo, Saijun Fan,Single-cell RNA sequencing of intestinal crypts reveals vital events in damage repair and the double-edged sword effect of the Wnt3/β-catenin pathway in irradiated mice,Redox Biology,2023．