10x Genomics单细胞转录组测序

  • 产品简介
  • 技术流程
  • 样本要求
  • 案例分析
  • FAQ


10x Genomics是基于微流控技术的单细胞文库制备系统,可以同时获得1,000-80,000以上的单细胞,通过测序实现对高通量单细胞数据进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析。10x Genomics单细胞表达分析可应用的细胞类型众多,如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、神经细胞、生殖细胞、胚胎细胞等,是研究肿瘤异质性,免疫细胞群体和胚胎发育的优秀方法。


应用领域
  • 癌症研究
  • 胚胎发育研究
  • 细胞异质性研究
  • 细胞分化研究
  • 免疫研究
样品要求
细胞分离由合作方或安诺完成单细胞悬浮液的制备。
样品类型活体新鲜完整细胞的细胞悬浮液;冻存的细胞悬浮液;不适于经固定、染色等处理的样本。
样品总量总量>6*105个,同一个细胞平行准备2份(1份质检,1份实验)。
样品浓度700-1200个/μl。
样品质量细胞不能成团,少碎片,存活率>90%,细胞直径<30μm,不存在逆转录抑制剂及非细胞的核酸分子
细胞冻存液保存分装保存于冻存液中,细胞冻存液:DMEM+20%FBS+10%DMSO。
冻存液细胞浓度100万个细胞/ml,每1ml分装至1个冻存管。
人远端肺类器官模型构建及SARS-CoV-2感染研究
Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids
期刊:Nature     发表时间:2020 11.25     影响因子:41.577
研究背景

远端肺部包含促进气体交换的末端细支气管和肺泡,具有重要的呼吸功能。目前在活体中远端肺上皮的人类干细胞种类是从小鼠模型推断出来的。因此,三维体外人远端肺培养系统将极大地促进病理研究,包括间质性肺疾病,癌症和SARS-CoV-2相关的COVID-19肺炎等。来自美国斯坦福大学医学院等研究机构的研究人员以成人肺泡上皮细胞II型(AT2)或KRT5+基底细胞为来源,培育出长期不含饲养细胞的化学限定性远端肺祖细胞培养物:远端肺类器官(organoid)。并以此模型进行了SARS-CoV-2感染研究。

设计思路

1.jpg


研究结果

克隆性肺泡和基底的类器官


远端肺组织体外培养,筛选远端肺祖细胞类型及培养条件。


免疫荧光成像(IF)观察到细胞增殖分化为SFTPC+ HTII-280+ AT2囊性类器官或表达基础KRT5的KRT5+固体类器官;


10X Genomics RNA测序证实了SFTPC+ AT2,KRT5+基底细胞和SCGB1A1+棒状细胞群。10x SPADE和Monocle拟时间分析揭示:共表达KRT5和SCGB1A1的细胞桥接了基础和棒状细胞种群,基底细胞和棒状细胞有分化关系;AT2 与基底细胞和棒状细胞没有谱系关系。


2.jpg

图1 人类远端肺克隆增殖


人类AT2细胞类器官特征


通过溶酶体染料从混合培养物中获得纯AT2细胞类器官。 EPCAM+ LysoTracker+ AT2细胞克隆扩增至180天。透射电子显微镜揭示了成熟AT2细胞的微绒毛和层状体(类器官可代表器官的一些特征)。当在玻璃上与血清一起培养时,AT2类器官会上调AT1标记(AT2可分化为AT1)。


混合的远端肺类器官或纯化的肺泡类器官的10X Genomics RNA测序揭示了肺泡群体中AT2细胞marker基因的高水平表达。未观察到AT2细胞亚群,并且细胞周期mRNA(cdk1,细胞周期蛋白依赖性激酶,pcna增殖细胞核抗原)并不局限于特定的AT2亚群。


3.jpg

图2 人类AT2细胞类器官特征


人类Basal细胞类器官分化及亚型


形态学观察:在混合的远端肺培养物中,Basal细胞类器官的生长比肺泡类器官的生长更快,并且最初形成了固体KRT5+球状体。到1个月时,约有50%的类器官形成了单腔或偶发多腔,并出现了沿内表面排列的棒状(SCGB1A1+ KRT5-)和纤毛(AcTUB+ KRT5-)细胞。当类器官由3D转移到2D气液界面(ALI)培养物中时,也发生了类似的分化。


10X Genomics RNA测序分析:KRT5+ Basal细胞的scRNA-seq聚类可重复地鉴定出两个种群:Basal1和Basal 2;Basal1有两个亚群Basal1.1,Basal1.2。Basal1包括活跃的循环亚群(Basal 1.2),富含增殖(PCNA,CDK1)和GSEA细胞周期marker基因。Basal1表达但Basal2不表达的基因,例如TP6317,ITGA6,ITGB4。Basal2富含水泡运输,内质网过程和鳞状标志物。


4.jpg

图3 基底类器官分化


TNFRSF12A+祖细胞表征


TNFRSF12A功能研究:锁定Basal1差异表达的基因TNFRSF12A。基因拟时间分析显示TNFRSF12A mRNA与增殖标记MKI67密切相关。当共表达EPCAM,ITGA6和ITGB4的Basal 1细胞分为TNFRSF12A低,中和高mRNA表达时,增殖基因模块在最高(TNFRSF12Ahi)与最低四分位数(TNFRSF12Alo)明显富集。为了确定这种相关性是否反映了内在的增殖潜能,研究者通过FACS将总的远端肺类器官分成了EPCAM+ITGA6+ITGB4+Basal 1细胞,然后是TNFRSF12Ahi和TNFRS-F12Aneg亚群,经培养显示前者具有更大的增殖形成类器官的能力。


Basal 1与Basal 2关系研究:通过FACS分为EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12Ahi(Basal 1)和EPCAM+ ITGA6-ITGB4-TNFRSF12Aneg(Basal 2)。富含Basal 2的基因SPRR1B和TMSB4X在Basal 1细胞类器官中被瞬时诱导,表明Basal 2有可能由Basal 1分化。


NOTCH抑制显著增加了来自TNFRSF12AhiEPCAM+ITGA6+ITGB4+细胞的基底类器官增殖,表明NOTCH抑制了生长。相反,NOTCH激动作用不影响增殖,但会诱导SCGB1A1(棒状细胞标志物)。


5.jpg

图4 TNFRSF12A+祖细胞表征


肺中TNFRSF12A+细胞的特征


人类远端肺的免疫染色显示,TNFRSF12A+基底细胞在细支气管沟的尖端或基部间歇性富集。体内的KRT5+基底细胞的TNFRSF12A+子集显示出比总KRT5+细胞更高的有丝分裂指数,与类器官scRNA-seq一致。人远端肺的FACS分析证实了TNFRSF12A在10.9%的基底细胞中表达。FACS分离的EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12Ahi细胞(即TNFRSF12Ahi Basal 1)是EPCAM+ ITGA6+ ITGB4+ TNFRSF12Aneg细胞(即TNFRSF12neg Basal 1)的15倍。 TNFRSF12Ahi基底类器官在长时间培养或转换为2D ALI时也分化为SCGB1A1+ 棒状和AcTUB+纤毛细胞。 整体而言,类器官模型可以表征人肺的部分特征,可以用于病理研究。


6.jpg

图5 人远端肺TNFRSF12Ahi基底细胞的特征


类器官模型研究SARS-CoV-2感染机制


严重的远端肺SARS-CoV-2感染会引起肺泡损害和呼吸衰竭,SARS-CoV-2的受体ACE2在棒状细胞和AT2细胞中表达,ACE2在基底类器官中结果一致。构建出的远端肺类器官具有顶端朝外的极性,这将ACE2展示在暴露的外表面上,从而促进SARS-CoV-2感染AT2细胞和基底细胞培养物,并鉴定出棒状细胞是一个新的可被这种病毒感染的目标群体。


7.jpg

图6 远端肺类器官的SARS-CoV-2感染研究


研究结论

研究者利用各类荧光标记成像,流式细胞分选,10x Genomics技术筛选到一些组合marker,成功从人类远端肺类器官培养物中筛选到了祖细胞并进行了类器官疾病建模。这种类器官系统应有助于对肺部病原体进行各种调查,类器官SARS-CoV-2感染发现SCGB1A1 +棒状细胞为新型靶标,其感染可能损害保护性肺糖胺聚糖并加速恶性感染周期。

参考文献

Salahudeen AA, et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids[J]. Nature. 2020 Dec;588(7839):670-675. doi: 10.1038/s41586-020-3014-1.

  • Q:10x Genomics单细胞转录组测序分析原理
    A:
    10x Genomics平台能够在7分钟内完成多至80,000个细胞的自动分选,每个油滴包裹凝胶珠(GEM)中含有单个细胞和逆转录反应体系。基因表达定量与细胞群体分类主要利用cell Barcode和UMI信息对单细胞中基因表达量进行分析,并根据表达量对单细胞群体进行划分,寻找群体间差异表达基因。