10x Genomics单细胞蛋白质组测序

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在10X单细胞转录组的基础上,利用10X Feature Barcoding技术和Biolegend设计的带有特异核酸序列的免疫组抗体(TotalSeq产品),可以同时获得大量单个细胞中基因的表达量和细胞表面蛋白的表达情况。在已知细胞表面标志性蛋白时,采用上述技术加入相应抗体,能帮助我们更精准的对细胞进行功能研究。


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图1 Feature Barcoding技术结合TotalSeq抗体捕获细胞表面蛋白原理图


上图左边为BioLegend公司推出的TotalSeq系列抗体,每个抗体链接着一段设计好的核酸序列 ,序列上有每种抗体独有的15bp的barcode序列,通过抗原抗体特异性结合,带有核酸序列的抗体会和细胞表面特定蛋白结合。之后通过右图所示10X Genomics Feature Barcode技术,可以捕获到抗体所带核酸序列,并通过UMI的数量,间接得到特定细胞表面蛋白的表达量。实现了一套样品进行实验处理和信息分析,可同时得到基因表达信息和表面蛋白表达信息。

应用领域
  • 肿瘤异质性
  • 免疫细胞群体
  • 胚胎发育等
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样品要求
样本类型新鲜细胞悬浮液、细胞冻存液。
样本总量总量>1.5*106(一般1X106个细胞对应抗体-核酸使用量为1μg,
另0.5*106个细胞用于细胞计数和活性检测)。
样本浓度请与现场实验人员协商调节浓度的方案。
样本质量

样本中活细胞百分比率大于90%;无大于40um的细胞碎片、组织碎片、纤维灰尘等各类杂质,总杂质含量经估算应<5%;

细胞呈单分散状态,细胞结团率<5%;

细胞悬浮液中不含逆转录抑制剂成分,不含游离核酸。
高通量单细胞技术助力筛选出多个新冠病毒高活性中和抗体
Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 identified by high-throughput single-cell sequencing of convalescent patients'B cells
期刊:Cell    发表时间:2020.5.17    发表单位:北京大学、首都医科大学、军事医学科学院、协和医学院     影响因子:41.582
研究背景

中和抗体由人体免疫系统产生,可以有效阻止病毒感染细胞。在新冠肺炎治疗方法中,小分子药物治疗针对性不足,目前疗效有限,而血浆疗法虽成效显著,但由于血浆来源有限,不能广泛使用。血浆疗法的有效成分是特异性强的中和抗体。利用高通量单细胞测序技术快速在康复期病人血液中寻找中和抗体,为新冠肺炎治疗争分夺秒。

研究思路

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研究结果

利用高通量单细胞测序技术筛选高活性的中和抗体


研究人员利用10X Genomics V(D)J +表面蛋白技术,在60余名恢复期患者体内收集血液样本,并在这些血液样本中,从8558个抗原结合的IgG1+克隆型(clonotype)中筛选出14种高强效中和抗体,其中表现强效的BD-368-2对SARS-CoV-2假病毒和真正的SARS-CoV-2病毒的IC50值分别为8pM和100pM。


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图1 通过10X Genomics V(D)J +表面蛋白的高通量单细胞 RNA 测序进行有效的中和抗体鉴定


BD-368-2抗体对SARS-CoV-2具有较强的治疗效果和预防保护作用


研究人员用hACE2转基因小鼠模型完成了中和抗体的体内抗病毒实验。将BD-368-2抗体注射到受感染的小鼠体内时,病毒载量降低了约2400倍;将BD-368-2抗体注射到未受感染的小鼠体内时,它们免受病毒感染,这些结果表明BD-368-2抗体对SARS-CoV-2具有较强的治疗效果和预防保护作用。


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图2 小鼠中和抗体治疗和预防实验(A)治疗组(绿色)


中和抗体BD-23的低温电镜结构


研究人员还获得中和抗体BD-23与刺突蛋白-胞外域三聚体形成的复合物在3.8埃分辨率下的 低温电镜结构,分析表明这种中和抗体的表位与ACE2结合位点相重合,基于SARS-CoV-2中和抗体的预测结构与SARS-CoV中和抗体相类似,人们可以高效筛选SARS-CoV-2中和抗体,从而大大加快筛选过程。


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图3 冷冻电镜(Cryo EM)观察到的中和抗体与S蛋白相结合的三维结构(A&B),(C) ACE2和中和抗体与S蛋白结合的位点重合


研究结论

文章通过10X Genomics V(D)J +表面蛋白组合的研究策略,通过对恢复期患者的血浆进行高通量单细胞测序,快速有效的筛选出14种中和抗体,这些高强效的中和抗体将可用于开发治疗性干预和预防SARS-CoV-2的药物,为治疗新冠肺炎提供有效途径。

参考文献

Cao Y, Su B, Guo X, Sun W, Deng Y, Bao L, Zhu Q, Zhang X, Zheng Y, Geng C, Chai X, He R, Li X, Lv Q, Zhu H, Deng W, Xu Y, Wang Y, Qiao L, Tan Y, Song L, Wang G, Du X, Gao N, Liu J, Xiao J, Su XD, Du Z, Feng Y, Qin C, Qin C, Jin R, Xie XS. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients' B Cells[J]. Cell. 2020 Jul 9;182(1):73-84.e16.

  • Q:10X Genomics单细胞表面蛋白研究策略?
    A:
    目前我司提供两种研究策略
    1. 10 X Genomics 3’单细胞转录组+表面蛋白文库
    2. 10 X Genomics 5’单细胞转录组+TCR/BCR+表面蛋白文库,每个转录组文库推荐测60K-100K reads,每个TCR/BCR/表面蛋白文库推荐测6-10K reads/cell。