三代人全基因组重测序

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三代人全基因组重测序是基于PacBio公司的测序平台进行人基因组的全面检测。利用三代长读长的测序优势有效鉴定人基因组的结构变异。

产品优势
  • 项目经验
    项目合作 1200+
  • 合作文章
    累计影响因子 250+
  • 项目团队
    1V1 医学项目服务
  • 医学多组学分析流程
    涵盖基因组、医学转录组及表观组等组学数据联合分析
  • 关注临床医学前沿的研究成果
    针对癌症/疾病的医学报告
  • 临床转化经验
    安诺血液病临床转化产品
  • 高通量测序平台
    中国基因科技行业的平台型企业(Sequel II,Sequel IIe等)
应用领域
  • 变异检测
  • 肿瘤研究
  • 单基因病
  • 复杂疾病
变异检测类型测序模式文库推荐数据量
三代人重全变异检测HiFi模式15/20kb DNA文库25 Gb HiFi


送样要求
DNA总量≥6.5µg
DNA浓度≥80 ng/μl
DNA纯度OD260/280: 1.8-2.0
OD260/230: 1.6-2.5
QC/NC比值: 0.5-2.0
其它要求凝胶电泳主带≥30kb, 无弥散、 无降解
不能反复冻融
不要暴露于高温(>65°C)
不要暴露于高低pH (<6 or >9)
无螯合剂.二价金属阳离子,变性剂和洗涤剂
HiFi测序揭示综合征性智力障碍的致病性结构变异(12-kb 拷贝中性倒位)
Pathogenic 12-kb copy-neutral inversion in syndromic intellectual disability identified by high-fidelity long-read sequencing
期刊:Genomics    发表时间:2021.02    影响因子:5.731    发表单位:日本横滨市立大学医学院
研究背景

智力障碍(Intellectual Disability,ID)是一种常见的发育障碍,其临床特征表现为认知水平低下和适应性能力缺陷。遗传和基因组变异是引起ID的主要原因,如细胞遗传学异常(插入、缺失、倒位和易位)、CNV(删除和重复)和SNP等。一对12岁的单卵双胞胎女孩(II-2和II-3)自5个月时起出现发育迟缓,眼睑严重下垂和癫痫发作,临床症状符合智力发育障碍(图1)。该病例曾进行全外显子测序分析,但未发现致病变异。

图1 患ID双胞胎的临床特征

设计思路

研究方案

样本选择:Trio家系(双胞胎女孩之一及其父母,II-2,I-1和I-2)

测序策略:三代 PacBio Sequel II 测序,构建15kb HiFi文库

研究结果

变异检测及关联位点筛选


先证者 (II-2) 及其父母 (I-1和I-2)测序深度分别为 20.4X,10.8X 和 10.1X,使用pbsv软件对Trio家系进行SV分析。在II-2中共检测到10,616个缺失、15,363个插入、63个倒位和1,476个重复。基于基因对功能的影响程度进行SV筛选,共发现11个缺失、2个插入、2个倒位和1个重复与RefSeq注释的外显子区域有重叠。其中,研究者在3号染色体上发现一个12 kb的倒位变异,IGV分析显示该倒位涉及BRPF1基因的前两个外显子和CPNE9基因的后四个外显子,这两个基因都被倒位变异破坏,可能导致基因功能丧失。而BRPF1基因异常会导致IDDDFP(OMIM#617333),其特征是智力残疾、面部特征畸形、颈椎融合和癫痫发作。


验证分析


Southern印迹分析显示仅在受影响的双胞胎(II-2和II-3)中检测到与倒位等位基因相对应的5.1 kb KpnI片段,而在其哥哥(II-1)和父母(I-1和I-2)中未检测到。根据pbsv软件的位置信息,研究者利用PCR确定倒位片段(chr3:9,767,386–9,779,615)在连接处没有核苷酸缺失/插入,且双胞胎女孩的倒位断点相同(图2b,c)。Sanger测序鉴定的两个断点连接点和pbsv检测相同,证明了HiFi长读长分析的准确性。

图2 12Kb的倒位变异及其验证结果


单倍体分型追溯倒位变异的来源


研究者通过WhatsHap等软件对目标变异区域进行单体型定相。先证者(II-2)的HiFi数据被分成22,363个单倍型块,平均块大小为84kb。12kb的倒位位于II-2中的321kb的单倍型块内。比较来自Trio家系(II-2,I-1和I-2)的分型结果,揭示了倒位染色体的来源。含染色体位置9,757,086 _ 9,757,754 _ 9,757,993 _ 9,775,730 _ 9,782,977的5个SNP的单倍型G_A_C_A_A证实了12kb倒位遗传自母亲。

图3 单倍型分析揭示倒位的来源

研究结论

本研究选用三代PacBio HiFi测序对患ID Trio家系进行SV检测分析,挖掘到到一个影响该疾病的12 kb倒位变异。此外,基于Trio家系的单倍型定相分析发现该倒位变异遗传自母亲。研究表明,PacBio测序技术可以发现之前短读长测序遗漏的致病变异。

参考文献

[1] Mizuguchi T, Okamoto N, Yanagihara K, et al. Pathogenic 12-kb copy-neutral inversion in syndromic intellectual disability identified by high-fidelity long-read sequencing[J]. Genomics. 2021, 113(1):1044-1053.

  • Q:三代人重测序的优势有哪些? 
    A:
    利用三代长读长和无PCR偏好性等技术优势能够弥补二代短读长鉴定大的结构变异不准确的缺点,另外二代测序存在GCbias,因此覆盖基因组不均一,很多高GC区域无法检测,对于这些二代测序覆盖不到的基因组复杂区域的变异信息包含SNP、Indel和SV,三代测序也能获取。
  • Q:想研究遗传病相关研究,如何取样比较好?
    A:
    尽量选择核心家系样本,既有患病子代又有父母。样本取材可以选择血液样本即可。