近日，安诺优达基因科技（北京）有限公司（以下简称：安诺优达）宣布正式与Oxford Nanopore Technologies（以下简称Oxford Nanopore）达成合作，引进Oxford Nanopore最高通量测序平台——PromethION，此举将进一步增强安诺优达在全球范围的大规模基因组学服务能力，扩大基因组中心的国际影响力。通过提供多种测序平台的协同服务，安诺全力服务合作伙伴，为生命科学多个领域，如农业、基础研究、医学和健康等领域的研究发展和成果转化提供核心工具。

PromethION是Oxford Nanopore推出的最新款超高通量测序设备，它支持实时、长读长、直接DNA和RNA测序工作流程。PromethION一次最多可运行48个测序芯片，每张测序芯片包含多达3000个纳米孔通道，最多一次可有144000个有效通道进行测序。所有芯片同时运行通量可达Tb级，能够满足科研用户超高通量的、快速周转测序需求。

PromethION 高通量测序仪

成立至今，安诺优达已具备大规模的研发及服务能力，建立了领先的实验体系，搭建了生物大数据云计算生态系统；配备了包含Oxford Nanopore PromethION、PacBio Sequel、Illumina HiSeq X Ten、NovaSeq 6000、NextSeq 550AR等新一代测序仪的大规模测序平台。今年7月，安诺优达南方中心——浙江安诺优达生物科技有限公司正式落成。多项举措将进一步拓展安诺优达在基因测序领域的战略布局，为打造国际领先的大规模基因组中心建立硬件基础，也为开展全球化的基因测序业务建立重要竞争力。

安诺优达

安诺优达总部位于北京，在浙江义乌建有南方中心，是中国知名的基因企业、亚洲一流的基因组中心。先后获得国家发改委首批基因检测技术应用示范中心、国家高新技术企业、北京生物医药产业跨越发展工程（G20工程）企业、中国最具投资价值企业、2016中国最具科技引领力企业等资质荣誉，并拥有博士后科研工作站。

公司专注于基因组学技术在人类医学健康和生命科学研究两大领域的产业化应用，目前已在测序设备和分子诊断试剂、医学检测与研究、科研服务、基因大数据和云平台服务等方面具备了优秀的产品体系，形成了覆盖业务上游、中游、下游的全产业链布局及强大的Bio-IT产业化服务能力，赢得了广大合作伙伴的高度认可。

Oxford Nanopore Technologies

Oxford Nanopore公司成立于2005年，专注于开发基于纳米孔科学的颠覆性电子单分子传感系统。Oxford Nanopore的新型电子DNA/RNA测序技术正用于一系列生物研究应用。包括大规模人类基因组学、癌症研究、微生物学、植物科学和环境研究。纳米孔技术具有完全的可扩展性。像Flongle这样的小型适配器解决了对按需、快速、小型测试或实验的需求，并且可以在实验室或现场使用。口袋大小的MinION是一款功能强大的便携式测序设备，可以提供大量长读长测序数据。对于较大的基因组学项目，台式GridIONX5可以按需一次运行多达五个MinION测序芯片。最近推出的PromethION是纳米孔测序的高通量设备，旨在按需使用多达48个测序芯片，每个测序芯片可提供超过百Gb的测序数据。

一直以来安诺技术助力合作团队在单细胞层面进行深入研究，近期，小编就陆续收到了合作伙伴们文章见刊的喜讯。在上个月中，安诺单细胞转录组测序文章两连发。下面小编就为大家一一解析这两篇文章，带大家深入了解单细胞转录组测序技术的应用。

Improving cell survival in injected embryos allows primed pluripotent stem cells to generate chimeric cynomolgus monkeys

发表期刊

Cell Reports

合作单位

昆明理工大学灵长类转化医学研究院

研究结果

研究团队在前期的探索中，利用dESCs（隆起形态的胚胎干细胞）成功产生了嵌合体猴。而在以往的报道中，传统培养的pPSCs（待发态多能干细胞）无法形成嵌合体动物。近期，研究团队通过优化培养条件，筛选出了适宜干细胞存活以及胚胎发育的ES-HECM-Y培养基。

利用该培养基，注射pESCs两天后的胚胎中，pESC-GFP细胞的存活率由对照中的0%提高到59.8%，表明ES-HECM-Y培养基显著提高了注射pESCs的存活率。后续将嵌合胚胎移植到受体母猴子宫内，使其顺利产下嵌合体猴。此外，研究者利用该方法，证实piPSCs（待发态诱导多能干细胞）和pNT-ESCs（待发态细胞核移植胚胎干细胞）同样具有产生嵌合体猴的能力。

团队进一步对各种干细胞注射的胚胎嵌合能力进行比较，发现dESCs具有最好的嵌合能力，pESCs、pNT-ESCs次之，piPSCs的嵌合能力最差。通过单细胞转录组测序，发现基于表达模式，dESCs与pESCs、pNT-ESCs、piPSCs分为不同的群，另外所有的细胞都表达猴子外胚层发育关键基因EOGs（epiblast ontogenic genes），但其表达水平在不同的细胞类型里存在一定差异，这种差异解释了为何不同细胞类型具有不同的嵌合能力。

图1 文章研究思路^[1]

图2 单细胞转录组测序相关分析^[1]

Loss of oocyte Rps26 in mice arrests oocyte growth and causes premature ovarian failure

发表期刊

Cell Death & Disease

合作单位

山东大学生殖医学研究中心

研究结果

在卵母细胞成熟的过程中，随着染色质构象的改变，细胞内基因的表达模式是呈动态变化的，随着卵母细胞的发育，转录活性升高，到成熟状态，转录活动静止。目前，其中的分子机制仍不明晰，研究团队基于卵巢中高表达的核糖体蛋白编码基因RPS26对这一机制进行了深入探索。

研究者敲掉小鼠卵母细胞中的Rps26基因，发现卵泡的发育受到阻滞，同时染色质构象也停滞在了NSN（非环绕细胞核）到SN（环绕细胞核）的转换期，最后所有的卵母细胞都无法存活，导致卵巢早衰。进一步研究发现，Rps26基因可能通过影响H3K4和H3K9的甲基化水平来调控染色质构象，Rps26基因的缺失致使卵母细胞中H3K4me3和H3K9me3水平降低，导致细胞的核形态无法顺利从NSN转到SN。

利用单细胞转录组测序技术，发现Rps26敲除小鼠卵母细胞，出现大量基因表达水平的异常，其中包括表观修饰相关的基因以及卵母细胞特异表达基因。深入分析发现，在突变体中，PI3K/Akt/Foxo3a通路相关基因的表达也出现异常。

图3 研究模型图^[2]

图4 单细胞转录组测序相关分析^[2]

从以上分享可以看出，在生殖领域的研究中，往往伴随着细胞数量少以及细胞异质性高两大难题，单细胞测序技术恰好能突破这两个局限，帮助科研工作者进行课题的深层次探索。

作为国内单细胞测序技术整体解决方案的测序服务提供商，目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品，覆盖三大组学（基因组、转录组、表观组），拥有丰富的项目经验、合作单位100+、物种经验50+、多篇高分文章IF累计100+，能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略，使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。

图5 安诺单细胞测序技术总览

参考文献

[1] Kang Yu, Ai Zongyong, Duan Kui, et al. Improving cell survival in injected embryos allows primed pluripotent stem cells to generate chimeric cynomolgus monkeys[J]. Cell Rep, 2018, 25:2563-2576.e9.

[2] Liu Xiao-Man, Yan Ming-Qi, Ji Shu-Yan, et al. Loss of oocyte Rps26 in mice arrests oocyte growth and causes premature ovarianfailure[J]. Cell Death Dis, 2018, 9:1144.

一直以来人们谈起“病毒”立即色变，非常恐慌，病毒一旦侵入宿主，会迅速繁殖，引起机体致病。问题来了，病毒为何具有超强的繁殖能力？在被入侵的宿主细胞中发生了什么样的变化引起机体病变？利用什么样的技术可以研究病毒与宿主的相互作用？今年发表在Nature Communications上的一篇文章给了我们答案，文章是利用Hi-C技术研究病毒与宿主的相互作用，研究发现DNA病毒入侵宿主基因组更倾向于接近宿主活跃染色质区域，这项研究有望从新的角度为我们揭开病毒超强繁殖能力的神秘面纱。

图1 病毒结合到宿主基因组活性染色质区域的可能工作模型^[1]

研究背景

文章利用两种DNA病毒侵染人肝癌细胞来展开研究。类型5腺病毒 (Ad5, adenovirus type 5)是科学家常用的DNA病毒模型，通常在宿主细胞因子及各种酶的帮助下完成自身DNA的复制和转录。另一种常用于研究的病毒乙型肝炎病毒（HBV, hepatitis B virus）在复制周期中需要经过逆转录阶段。这两种繁殖方式存在差异的DNA病毒，在侵染宿主细胞时与宿主染色体结合的区域相同吗？为什么要结合在这些区域？在侵染完成之后宿主染色体三维结构是否发生变化？发生的变化是否一致？关于这些问题，文章中做了详细的解析。

文章介绍

1.样本类型：人肝癌细胞系

2.研究策略：Hi-C+ChIP-seq+RNA-seq

3.发表期刊：Nature Communications

4.影响因子：12.124

5.发表时间：2018.10.15

文章思路

图2 文章思路图

主要研究结果

HBV感染

文章首先研究了病毒侵染后宿主染色体三维结构及表观修饰等方面是否发生变化。结果显示HBV侵染之后，宿主染色体的三维结构（A/B Compartments）、基因表达、组蛋白修饰都没有发生明显的变化（图3）。HBV基因组倾向于与宿主基因组的活跃区域结合，包括CpG岛区域，这些结合区域富含在侵染过程中highly expressed及deregulated 基因。

图3 HBV侵染宿主细胞，宿主染色体三维结构（A/B Compartments）、基因表达、组蛋白修饰都没有发生明显的变化^[1]

我们很好奇这些区域与病毒的超强繁殖能力有什么样的关系?研究发现这些区域通常甲基化程度很低，细胞因子CXXC finger protein 1( Cfp1)可以结合到非甲基化的CpG岛并且伴随着H3K4me3的富集而形成一种活跃的染色体状态。有趣的是病毒DNA的甲基化及H3K4me3的富集也影响着病毒的转录。我们在人肝癌细胞中敲低Cfp1后HBV的转录水平下降，验证了病毒与这些区域的结合更有利于病毒自身转录的发生（图4）。

图4 敲低Cfp1后HBV的转录水平下降^[1]

Ad5侵染

不同的病毒侵染过后，宿主染色体三维结构变化是否相同？与HBV不同的是，相比用Ad5侵染四天的宿主细胞，侵染7天的宿主染色体三维结构（A/B Compartments）、基因表达、组蛋白修饰均发生明显变化（图5），并且Ad5更倾向于与宿主基因组的TSSs和enhancers染色质区域结合。

图5 Ade病毒侵染宿主细胞，宿主染色体三维结构（A/B Compartments）、基因表达、组蛋白修饰都发生明显的变化^[1]

文章主要结论

利用Hi-C技术研究在人肝癌细胞中侵染HBV和Ad5两种DNA病毒之后宿主基因组三维结构的变化及相互作用情况，发现：

1）HBV侵染不能改变宿主染色体三维结构，Ad5侵染能够改变宿主染色体三维结构；

2）HBV倾向于与富含细胞因子Cfp1的CpG岛区域结合，而CpG岛通常富含在侵染中highly expressed 及deregulated 基因；Ad5则更倾向于和TSSs位点及enhancers区域发生相互作用；

3）病毒靶定到特定的区域的特性有利于自身的复制和转录。 

看到这里，大家是否跟小编一样惊叹于Hi-C技术的强大！小伙伴们，如果你现在正面临着常规技术无法解决的互作研究，不如让Hi-C来帮你搭座桥，跨越难关，高分文章不是梦！

安诺Hi-C

作为业内三维基因组测序技术的引领者，安诺基因实现了动物、植物、微生物多物种高质量建库和大数据分析，文库经验900+。合作发表文章累计影响因子97.19，平均影响因子12.125。有经验的渔夫更能对抗风暴！让安诺基因为您的科研保驾护航~

参考文献

[1] Pierrick Moreau, Axel Cournac, Gianna Aurora Palumbo, et al. Tridimensional infiltration of DNA viruses into the host genome shows preferential contact with active chromatin[J]. Nature Communications, 2018, 9:4268.

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时下最火的科研技术当属单细胞测序，而单细胞测序的一大难点在于细胞的分选。目前已有多种技术匹配不同的样本（干货~如何分选单细胞？），比如流式细胞分选以及微流控分选，都是高通量的单细胞分离技术，但这些技术对细胞悬浮液的总量以及活性都有一定的要求，因此制备高质量的单细胞悬浮液成为实验成功的关键点。今天小编就为大家整理了常见样本的单细胞悬浮液制备方法，干货满满哦！

PBMC

新鲜外周血收集于EDTA抗凝管，加入HISTOPAQUE-1077（Sigma-Aldrich），离心后淋巴细胞位于血浆-HISTOPAQUE-1077的交界层，吸取淋巴细胞层于新管，用PBS（Invitrogen）清洗细胞2次，重悬细胞可制得PBMC细胞（外周血单个核细胞）悬浮液^[1]。

脑组织

收集新鲜小脑组织于95% O₂和5% CO2的人造脑脊液体中，分离组织并置于hibernate E medium（Invitrogen）中，加入BTDM1，2mg/mL collagenase IV（Gibco），10 U/μL DNaseI（NEB）进行消化。吹打组织使其分散成小块，加入BTDM2，1 mg/mL papain（Sigma）和10 U/μL DNase I再次消化，在37℃涡旋处理5min，300g 离心5 min，放于冰上，弃掉上清，加入500 μL hibernate E medium轻轻重悬制得细胞悬浮液^[2]。

小肠组织

新鲜小肠组织分离后用冰冷的PBS冲洗，切成2mm长的小块，置于20 mM EDTA–PBS在冰上孵育90min，每30min晃动一次。而后晃动样本，收集上清。置换新鲜EDTA–PBS，继续孵育，每30min收集一次上清。最终的收集物用PBS清洗两次，300g离心3min，用TrypLE express（Invitrogen）于37℃处理1min，过40μm滤筛，制得单细胞悬浮液^[3]。

肝组织

将新鲜肝组织切成1mm³小块，在RPMI-1640 medium（Invitrogen）+10% FBS环境中于40mm细胞筛（BD）上用20mL注射器柱塞缓慢研磨，直至获得均一细胞悬浮液。细胞悬浮液逐步过筛，PBS清洗两次，400g离心10min，弃掉上清，加入red blood cell lysis buffer（Solarbio）在冰上孵育2min破裂红细胞，PBS清洗两次，重悬制得细胞悬浮液^[1]。

动脉组织

动脉组织分离后，置于冰上 1mL RPMI media（Gibco）+10% FCS环境中，切成小块， 在包含450 U/mL Collagenase I（Sigma Aldrich）+250 U/mL Collagenase XI（Sigma Aldrich）+120 U/mL Hyaluronidase（Sigma Aldrich）+120 U/mL DNaseI（Worthington）的HBSS溶液中，37℃消化1h。之后悬浮液过40μm滤筛^[4]。

不难看出，各类组织制备单细胞悬浮液的方法都不尽相同，最适宜的制备方法往往需要摸索。目前，安诺单细胞团队助力广大科研工作者，已整理提供单细胞悬浮液制备参考文献30+，是您专业的样本制备顾问。如您需要特殊样本的细胞悬浮液制备参考，欢迎与当地销售经理联系，我们会给您提供一对一的专业服务。

安诺单细胞测序技术总览

作为国内单细胞测序技术整体解决方案的服务提供商，目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品，覆盖三大组学（基因组、转录组、表观组），拥有丰富的项目经验、合作单位100+、物种经验50+、多篇高分文章（IF累计100+），能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略，使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。

参考文献

[1] Zheng Chunhong, Zheng Liangtao, Yoo Jae-Kwang, et al. Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing[J]. Cell, 2017, 169: 1342-1356.e16.

[2] Zhong Suijuan, Zhang Shu, Fan Xiaoying, et al. A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex[J] . Nature, 2018, 555:524-528.

[3] Haber Adam L, Biton Moshe, Rogel Noga, et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium[J]. Nature, 2017, 551(7680):333-339.

[4] Winkels Holger, Ehinger Erik, Vassallo Melanie, et al. Atlas of the immune cell repertoire in mouse atherosclerosis defined by single-cell RNA-sequencing and mass cytometry[J]. Circ. Res., 2018, 122: 1675-1688.