单细胞测序技术为生物学的发展带来了革命性的变化，目前应用广泛的是10x Genomics为代表的高通量单细胞转录组，但由于其芯片通道大小和微流控原理的限制，该技术不适用于形状不规则且直径大于40 μm的细胞，及细胞量极少的样本。相比之下，Smart-seq技术可以对单个细胞或少量细胞直接进行扩增建库，无细胞类型限制且单个细胞获取的基因数量更多，仍旧被广泛应用于胚胎发育、生殖、神经科学等领域，为这些领域的研究提供强大的技术支撑。
Smart-seq单细胞转录组技术流程
近日，西北农林科技大学苏建民教授在Journal of Biological Chemistry (JBC)期刊上发表了题为Single-cell RNA-seq and single-cell bisulfite-sequencing reveal insights into yak preimplantation embryogenesis的研究文章。该研究利用单细胞转录组（Smart-seq）和单细胞甲基化测序（single cell bisulfite-sequencing）等方法探索了牦牛早期胚胎发育的复杂调控机制，揭示了表观遗传重编程和转录调控网络之间的动态关系，并绘制了调控胚胎基因组激活（EGA）阶段的重要候选基因网络。研究结果有助于进一步了解EGA事件，为牦牛改良畜群的扩大和种质资源的保护奠定基础。
安诺优达提供了Smart-seq单细胞转录组和单细胞BS-seq的建库测序和分析服务。
文章简介
胚胎着床前的发育是一个复杂的过程，伴随着一系列关键的生物学事件。这些事件与合子基因组激活（ZGA）发生相协调。哺乳动物的ZGA过程依赖于由各种信号分子精确调控的网络基因表达程序。正常的胚胎基因组激活（EGA）对于持续发育是必要的，而异常激活则导致胚胎发育失败。然而，在哺乳动物，特别是在牦牛的研究中，对早期胚胎发育期间EGA的复杂调控机制了解甚少。
材料&方法
材料：体外培养的牦牛MII卵母细胞和五个发育阶段（2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚、囊胚）样本；每个时期5-8个细胞/胚胎，每个时期生物学重复3次
方法：Smart-seq和单细胞BS-seq
研究结果
牦牛早期胚胎不同发育阶段的单细胞图谱
首先，作者利用Smart-seq技术对体外培养的MII卵母细胞和五个发育阶段的胚胎进行了转录组图谱绘制。其中MII卵母细胞中表达的基因数量最少；在卵母细胞和桑葚胚阶段的基因表达变化最大，可能发生了母源—合子的转变。
早期胚胎发育过程中基因表达变化
作者接着通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）确定了核心遗传网络。动态基因表达模式分析中，簇6的基因表达水平在2-细胞阶段增加，并在桑葚胚阶段减少，表明其中的PAX9、MXD1和WWOX等基因仅参与胚胎基因组激活。
在8-细胞期到桑葚胚期鉴定出了最多的差异表达基因（DEG），表明牦牛胚胎基因组在这一转变过程中被激活，也是主要的EGA阶段。GO、KEGG和GSEA的结果表明，母系转录物在MII卵母细胞至2-细胞期为EGA编程了表观基因组。
通过跨物种转录组分析，鉴定出了保守的母系枢纽基因（UHRF1、PRC1、ASF1B、SIN3A和 LOC618599）以及保守的合子枢纽基因（HDAC1/2、DPPA2、HSPD1和MRTO4）。这些枢纽基因在早期胚胎发育过程中充当“主调节器”。
早期胚胎发育过程中甲基化特征
作者通过单细胞BS-seq研究了DNA甲基化对早期胚胎发育的影响。发现在2-细胞阶段具有较高的甲基化水平，而到了4-细胞期，甲基化水平迅速下降，并在8-细胞期达到最低水平，随着甲基化的再次发生，桑葚胚胎期的甲基化达到最高水平。
作者通过差异甲基化区（DMR）分析分别发现了79,375个（8细胞期到桑葚胚阶段）、14,919个（2细胞到4细胞阶段）、12,097个（4细胞到8细胞阶段）与DMRs相关的DNA区域。在高甲基化区域中，USP7的一段4.2kb区域富含DMR。GO和KEGG的结果表明合子基因的转录激活，可能是由于DNA甲基化作用。
转录组和甲基化组动态变化的相关性
将Smart-seq和单细胞BS-seq数据进行联合分析，发现在8-细胞阶段高表达的DEG中，甲基化基因的比例更高。在桑葚期观察到相反的趋势。在4-细胞和8-细胞阶段的DEG中，甲基化基因的比例更高。在不同发育阶段，基因启动子区域的变化趋势相同，基因表达水平与其对应的DNA甲基化水平呈负相关。整体甲基化水平方面，基因表达水平与其对应的DNA甲基化呈正相关。2-细胞阶段启动子甲基化高于4-细胞阶段，而桑葚胚启动子甲基化低于8-细胞阶段。并鉴定出可能与胚胎发育相关的甲基化驱动基因：UHRF1、AURKA、PLK1、TOP2B、CENPF、NUSAP1和CDC25B。
HDAC1/2和USP7对牦牛胚胎发育的影响
最后，结合实验验证，抑制HDAC1/2或USP7的功能可降低囊胚的发育率及质量。表明HDAC1/2和USP7对于牦牛的植入前胚胎发育的重要性。
文章结论
作者通过Smart-seq和单细胞BS-seq分析，探讨了牦牛早期胚胎发育EGA阶段，表观遗传重编程和转录调控网络之间的动态关系，揭示了HDAC1/2和USP7等转录因子在早期发育阶段的重要作用。