DNBelab C4是基于液滴微流控技术的单细胞文库制备系统，通过mRNA捕获磁珠和液滴识别微珠可以同时获得500-12,000以上的单细胞，制备文库和DNBSEQ-T7平台兼容，通过测序实现对高通量单细胞数据进行细胞群体的分类以及细胞群体间基因表达的差异分析。DNBelab C4单细胞表达分析可应用的细胞类型众多，如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、神经细胞、生殖细胞、胚胎细胞等，是研究肿瘤异质性，免疫细胞群体和胚胎发育的方法。
| 送样要求 | |
| 细胞分离 | 由合作方或安诺完成单细胞悬浮液的制备 |
| 样品类型 | 活体新鲜完整细胞的细胞悬浮液；冻存的细胞悬浮液；不适于经固定、染色等处理的样本 |
| 样品总量 | 细胞悬浮液，一个样本细胞起始量一般不低于 1x106 个 |
| 样品浓度 | 最低浓度一般不低于 1x103 cells/µL |
| 样品质量 | 活细胞数在 90% 以上；细胞直径<40μm；单细胞悬液中无明显杂质，无细胞碎片，无细胞黏连（黏连比例小于5%），无红细胞干扰 |
| 细胞冻存液保存 | 分装保存于冻存液中，配制冻存液：90% FBS+10% DMSO |
| 冻存液细胞浓度 | 细胞悬液浓度 5×106 ~1×107 个/mL，每 500 μL 分装至冻存管中 |
在体外建立并解析人8细胞期胚胎样细胞
Rolling back of human pluripotent stem cells to an 8-cell embryo-like stage
期刊：Nature 发表时间：2022.03.21 影响因子：69.504
人类受精卵形成初期，自身基因不表达，而需要依赖卵子携带的母源因子执行细胞功能。随着受精卵的不断分裂，当到达8细胞期时，卵子来源的母源因子逐渐降解消除，而胚胎自身的基因被激活，个体开始依赖自身的基因表达完成后续发育。8细胞期发生的该过程被称作合子基因组激活，是胚胎发育的关键节点，该过程的异常可直接导致胚胎发育的停止。因此，研究8细胞期细胞调控机制对于保证良好的早期胚胎发育有重要意义。
研究团队通过系统性的筛选，首次建立了体外全能性8CLC的诱导和富集方法。基于DNBelab C4平台，对8CLC诱导过程的细胞样本进行了单细胞转录组（scRNA-seq）和染色质可及性（scATAC-seq）测序，详细分析了8CLC群体的特征，并在多个诱导时间点描绘了8CLC诱导过程中转录组和染色质开放性的动态变化，为研究人类8细胞期的合子基因组激活和发育调控提供了重要的平台和资源，将拓展我们对人类早期胚胎发育的有限认知。
研究者在前期通过筛选，建立了新型的人类8CLC体外诱导培养基e4CL和两种不同的8CLC诱导方法：直接诱导法和阶段诱导法（图1a）。诱导后获得的全能性细胞（8CLC）比例为10-15 %，随后构建了可用于筛选纯化8CLC的报告基因细胞系，该细胞系能够帮助我们对大量纯化8CLC进行功能和机制研究。为了测试此诱导方法产生的8CLC反应8C胚胎细胞的相似度，研究者将阶段诱导法获得的8CLC与体内胚胎数据进行了整合（图1b）。诱导的细胞逐渐从类似胚胎第7天（E7）的状态回到类似胚胎第5天（E5），当诱导结束时，细胞与胚胎第三天（E3，即8细胞期）类似（图1b）。同时还从染色质开放状态、DNA甲基化修饰等多个角度验证了8CLC和8细胞期胚胎的相似性。
图1 人全能性8CLC的诱导方法及与胚胎发育时期的比较
为了探究8CLC的调控网络，研究团队基于单细胞测序数据，使用加权基因共表达网络分析（scWGCNA）定义了共表达模块和中枢基因。8CLC GRN的核心参与者包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4和DUXA等（图2a）。此外，团队比较了同一时间点8CLC与其他细胞（非8CLC）中的差异表达基因（DEG）。对其中表达差异最显著的DPPA3和TPRX1进行了功能实验验证，发现DPPA3和TPRX1是8CLC状态建立的关键调控因子。通过这部分内容，研究者提供了8CLC转换的分子路线图，并且剖析了其中的调控网络，鉴定出DPPA3和TPRX1为诱导8CLC的两个核心因子。
图2 8CLC基因调控网络和核心调控因子DPPA3、TPRX1 的功能验证
利用纯化的8CLC，研究团队从滋养层细胞分化能力、模拟人类囊胚形成能力和畸胎瘤分化过程中产生胚外组织细胞的能力等方面系统评估了8CLC的分化潜能。利用囊胚内细胞团标记蛋白OCT4 和滋养外胚层标记蛋白GATA2进行免疫荧光，验证了8CLC产生的类囊胚在标记蛋白上与囊胚的相似性（图3a）。此外，研究者对该类囊胚结构进行了单细胞转录组测序，分析结果显示全能性8CLC产生的类囊胚具有上胚层、下胚层和滋养外胚层，与胚胎构成类似（图3b,c）。为了检测8CLC的发育潜能，研究者利用不同多能性状态的细胞和分选出的8CLC产生畸胎瘤，并进行了基于DNBelab C4平台的高通量单细胞转录组测序。实验共得到了227,598 个单细胞，注释出24种细胞类型。结果显示，分选的8CLC来源的畸胎瘤包含胚胎外滋养细胞谱系和更丰富的其他谱系如生血内皮细胞和免疫细胞等（图3d）。总的来说，8CLC具有胚胎的三胚层和胚外的滋养层发育潜能，即具有全能性，在功能层面上与人类8细胞期细胞的分化能力契合，是研究人类早期胚胎发育的可靠材料。
图3 利用类囊胚模型和畸胎瘤实验验证8CLC全能性发育潜能
该研究项目填补了体外人8细胞期胚胎样细胞的空白，与人多能性状态的细胞相比，全能性的8CLC具有更好的发育和分化能力等众多优势。该成果对早期胚胎发育相关的基础研究提供了新的体外研究体系，有助于我们理解早期胚胎发育过程及其调控网络与疾病发生的关系，为防治出生缺陷及多种发育源性疾病提供理论基础和可行路径；同时也为全能性细胞用于细胞治疗和疾病建模提供了更好的模型选择。
Mazid, M.A., Ward, C., Luo, Z. et al. Rolling back human pluripotent stem cells to an eight-cell embryo-like stage[J]. Nature 605, 315–324 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04625-0
